[发明专利]一种液相色谱串联质谱法检测意蜂蜜和中蜂蜜中王浆主蛋白5的方法

权利要求书

1.一种液相色谱串联质谱法检测中蜂蜜和意蜂蜜的王浆主蛋白5的方法，其特征在于，包括：在对待测蜂蜜进行预处理后，通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中王浆主蛋白5的特征肽段，所述特征肽段包括肽段:意蜂蜜特征肽段：YLDYDFGSDER；中蜂蜜特征肽段：NLANSMNVIHEWK；

后在质谱图中提取属于所述中蜂蜜特征肽段和所述意蜂蜜特征肽段的质荷比，若待测蜂蜜在正确的保留时间中仅提取出所述中蜂蜜特征肽段，且子离子也符合，则可判断为中蜂蜜；若待测蜂蜜在正确的保留时间中仅提取出所述意蜂蜜特征肽段，且子离子也符合，则可判断为意蜂蜜；若待测蜂蜜在正确的保留时间中同时提取出了所述中蜂蜜特征肽段和所述意蜂蜜特征肽段，且子离子也符合，则判断为中、意蜂蜜混掺；

所述预处理包括如下流程：将待测蜂蜜以10g:10mL的比例溶解于去离子水中，离心取上清得到蛋白质溶液；

将所述蛋白质溶液以100 μL: 400 μL的比例与40 mM NH₄HCO₃混合，并加入50μL的30mM DTT溶液，室温反应60min，然后再加入DTT溶液5倍体积的100 mM IAA溶液在室温下暗反应60 min；

再加入胰蛋白酶溶液，37℃过夜酶切，所述胰蛋白酶溶液和所述蛋白质溶液比例为30μL: 100 μL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

A、对真实的中蜂蜜和意蜂蜜进行酶解，酶解产物除盐后干燥，用0.1%的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；

B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出专属于意蜂蜜的王浆主蛋白5的特征肽段和中蜂蜜的王浆主蛋白5的特征肽段；

C、提取待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本，使用液相色谱串联质谱检测；

D、在质谱检测结果中提取筛选的特征肽段，以鉴别蜂蜜为意蜂蜜或中蜂蜜。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A中采用纳升级高效液相色谱系统串联超高静电场轨道阱傅里叶变换台式质谱高分辨质谱仪；步骤C中采用三重四级杆或QExactive plus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，意蜂蜜的王浆主蛋白5的特征肽段YLDYDFGSDER在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z 690.29114的质荷比，包含质荷比为m/z 1103.42761、m/z 710.31039的子离子，检测允许偏差在10 ppm以内；中蜂蜜的王浆主蛋白5的特征肽段NLANSMNVIHEWK在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z 519.26104的质荷比，包含质荷比为m/z 712.37769、m/z 599.29362的子离子。

5.权利要求1-4任一项所述方法在意蜂蜜和中蜂蜜真实性评价中的应用。