[发明专利]一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法

权利要求书

1.一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，其特征在于：包括：

S1：获取单核细胞：

取新鲜脐带血，从所述新鲜脐带血中分离得到单核细胞；

S2：制备5*10⁵cells/mL的CD34+HSC细胞液：

将所述单核细胞通过CD34+微珠试剂盒分离得到CD34+HSC细胞液，将所述CD34+HSC细胞液调整至浓度为5*10⁵cells/mL，然后将所述5*10⁵cells/mL的CD34+HSC细胞液保存至注射；

S3：NSG小鼠免疫模型的构建：

取3周龄且做过清髓处理的NSG小鼠，通过尾静脉注射所述5*10⁵cells/mL的CD34+HSC细胞液，然后在尾静脉注射后的第4周开始每隔两周对NSG小鼠进行免疫学指标检测，当NSG小鼠血液中的hCD45大于或等于25％，得到NSG小鼠免疫模型；

S4：获得双人源化肿瘤异种移植模型：

取复苏成功的样本，在小鼠身上进行传代，将大小为2*2*2mm³，传至P5代且肿瘤生长速度稳定的样本接种至所述NSG小鼠免疫模型内，得到双人源化肿瘤异种移植模型；

所述S1中获取单核细胞的方法为：通过合法申请获取脐带血，将新鲜脐带血在采血后24小时内送达实验室，然后用磷酸盐缓冲液1：3稀释血液，在Ficoll培养基上用密度梯度离心法分离单核细胞；再从所述单核细胞分离纯化得到CD34+HSCs细胞；

所述单核细胞分离的步骤如下：

①按照14mL人淋巴细胞分离液Ficoll：30mL所述稀释血液，先加人淋巴细胞分离液Ficoll，后加入稀释后血液，离心30min，离心力900g，离心后移除上层血浆，留下2mL在分离界面层；

②转移所述分离界面层至新的50mL离心管，加入30mL 0.9％质量浓度的NaCl溶液，离心力400g,4℃离心5min，弃上清液，加入0.9％质量浓度的NaCl溶液，使总体积为10mL，重悬细胞；

③通过细胞计数和活力测定，取1*10⁵个混合细胞进行流式检测；

④离心力400g，4℃离心所述重悬细胞，得到所述S2所需的新鲜分离的CD34+HSCs细胞；

所述S3中免疫学指标检测的方法如下：

①将尾静脉注射后的3周龄NSG小鼠断尾取血80～100μL，加入10μL EDTA抗凝；

②加入荧光标记的单克隆抗体，包括抗鼠CD45，抗人CD45,CD3,CD19,CD4,CD8；

③室温避光孵育20min，加入1mL流式细胞分析用溶血素，充分混匀；

④室温静置10min，加入2mL PBS,混匀，离心1500rmp，5min，弃上清液；

⑤再加入2mL PBS重悬细胞，混匀，离心1500rmp，5min，弃上清液；

⑥加入220μL PBS重悬细胞，进行流式检测；

所述S4中，接种P5代且肿瘤生长速度稳定的样本的NSG小鼠免疫模型，每周观察2次所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤的生长及小鼠的体重，当所述NSG小鼠免疫模型内肿瘤体积达到80mm³时，即建立双人源化肿瘤异种移植模型。

2.根据权利要求1所述的一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，其特征在于：S2中所述5*10⁵cells/mL的CD34+HSC细胞液在温度为4℃的环境中进行保存。

3.根据权利要求1所述的一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，其特征在于，获取S3中所述3周龄且做过清髓处理的NSG小鼠的方法为：

用功率为100cGy/min的X射线照射三周龄NSG小鼠全身2.4min。

4.根据权利要求1所述的一种双人源化肿瘤异种移植模型的构建方法，其特征在于：尾静脉注射所述5*10⁵cells/mL的CD34+HSC细胞液的最佳时间为3周龄NSG小鼠照射X射线后4～24小时。