[发明专利]静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法

权利要求书

1.一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)3位保护：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；

(2)静息细胞转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683诱变菌种经过斜面培养和液体种子培养后，种子过滤分离，加入到PBS缓冲体系中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；

(3)提取：将步骤(2)中所得发酵产物静置分层，上层菌液抽入烧杯中备用；下层固体抽滤，得固体产物，滤出液与所述上层菌液合并，套用于下批次静息细胞转化；

(4)水解:将步骤(3)中所得固体产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；

(5)精制：将步骤(4)中所得水解产物进行精制提纯，得到孕甾-5-烯-3β,21-二醇产品。

2.根据权利要求1所述的一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲缩醛与植物甾醇的质量比为3-20:1。

3.根据权利要求1所述的一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，其特征在于，所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；

(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；

(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；

(4)种子罐培养：

培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，按上述配方配制培养基，121℃灭菌30min；将二级种子液按体积比10％接种至种子培养基，培养参数：于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌速度50-500rpm，罐压0.05-0.06MPa条件下培养，培养时间14-96h。

4.根据权利要求1所述的一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，其特征在于，步骤(2)中转化培养基配方包括以质量百分比计的以下成分：植物甾醇醚化物1-10％，羟丙基-β-环糊精1-40％，菌体2-20％，余量用20mM pH＝8.0的PBS补足。

5.根据权利要求4所述的一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，其特征在于，所述植物甾醇醚化物粉碎至200目。

6.根据权利要求1所述的一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的静息细胞转化方法具体为：按所述配方配制转化体系，于28-32℃，搅拌速度50-500rpm，空气流量0.5-1.0vvm，罐压0.05-0.06MPa条件下转化。

7.根据权利要求1所述的一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，其特征在于，所述步骤(4)中水解方法具体为：将所述固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌1h，抽滤，滤饼淋洗后作为固废，合并滤液，45℃减压浓缩至无馏分，加入5％盐酸，升温至60℃，水解1-2h，HPLC跟踪至反应完全，抽滤，弃滤液，收集滤饼，得水解产物。

8.根据权利要求1所述的一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，其特征在于，所述步骤(5)精制方法具体为：将所述水解产物70℃烘干，加入甲醇溶解、抽滤，滤液减压升温浓缩至小体积，降温、抽滤、烘干得到粗品；将所述粗品加入石油醚，升温、回流打浆、冷却、过滤得类白色固体，烘干后，加入甲醇升温溶解，减压浓缩至糊状，降温至0-4℃，养晶2小时后抽滤烘干。