[发明专利]静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法

说明书

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种静息细胞法制备孕甾‑5‑烯‑3β,21‑二醇的方法。发明内容包括(1)植物甾醇的3位保护、(2)静息细胞转化、(3)提取、(4)水解、(5)精制步骤。本发明以植物甾醇为原料生产孕甾‑5‑烯‑3β,21‑二醇，原料易得，降低了生产成本；本发明采用保护剂对植物甾醇3位羟基进行官能团保护，发酵后水解可直接制得孕甾‑5‑烯‑3β,21‑二醇，副产物少，收率更高，反应路线更短，省掉了许多传统制备方法所需要的反应步骤和后处理步骤。

技术领域

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法。

背景技术

孕甾-5-烯-3β,21-二醇是甾体合成中重要的中间体，传统的工艺是利用3位酮基的类似结构，用化学方法选择性还原3位酮基为β羟基得到的产品，常常带有一定量的3位α羟基异构体，收率低且步骤繁琐，使用多种有机试剂容易带来污染。

菌株Mycobacterium sp.B-NRRL 3683记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高4-AD和ADD的收率。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种高收率，高质量，低污染，易操作的静息细胞转化植物甾醇制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，包括以下步骤：

(1)3位保护：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；

(2)静息细胞转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683诱变菌种经过斜面培养和液体种子培养后，种子过滤分离，加入到PBS缓冲体系中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；

(3)提取：将步骤(2)中所得发酵产物静置分层，上层菌液抽入烧杯中备用；下层固体抽滤，得固体产物，滤出液与所述上层菌液合并，套用于下批次转化；

(4)水解:将步骤(3)中所得固体产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；

(5)精制：将步骤(4)中所得水解产物进行精制提纯，得到孕甾-5-烯-3β,21-二醇产品。

优选地，所述步骤(1)中甲缩醛与植物甾醇的质量比为10-40:1。

优选地，所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；

(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；

(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；

(4)种子罐培养：