[发明专利]一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法

权利要求书

1.一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)在斑马鱼kdrl的第12个外显子两端寻找两个核酸酶的特异识别位点，所述的特异识别位点为sgRNA1靶点和sgRNA2靶点；

(2)构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左同源臂序列和左同源臂序列中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1，右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源基因的核苷酸序列，包括第12个外显子两侧的loxP位点和可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白；利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中；将注射的受精卵培养成鱼，通过荧光和基因型鉴定确认kdrl条件性敲除斑马鱼；

(3)利用标记斑马鱼血管内皮细胞的转基因品系与上述条件性敲除品系杂交，通过荧光筛选获得双转基因品系；

(4)将Cre mRNA注射至上述的双转基因内交产生的胚胎中，3天后斑马鱼胚胎用于鉴定kdrl的删除、整体表型观察和血管生长的表型观察。

2.根据权利要求1所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸酶。

3.根据权利要求1所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的核酸酶体系包括Cas9蛋白或产生Cas9蛋白的mRNA，sgRNA1和sgRNA2，kdrl敲入质粒。

4.根据权利要求3所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，sgRNA1的靶点序列为：Gtaaacagtctgtgaacccc；sgRNA2的靶点序列为：Gtgagaggggtacagtacgg。

5.根据权利要求4所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的第7-692位所示，所述的右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的第2577-3873位所示，所述的右臂之间含有需要置换的外源基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的第693-2576位所示。

6.根据权利要求5所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的构建非同源末端连接的敲入质粒的左同源臂、右同源臂，以斑马鱼基因组为模板，并在PCR引物加入酶切位点和保护碱基扩增获得；第四个外显子两个loxP位点间的序列，以斑马鱼基因组为模板，以loxP和frt融合序列PCR引物扩增获得loxP-kdrl_exon12-frt融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基；可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白序列，以loxP和frt融合序列PCR引物扩增获得loxP-myl7-DsRed-pA-frt融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基。

7.根据权利要求6所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，敲入供体质粒，并注射斑马鱼受精卵，筛选获得tcf3a的条件性敲入品系。

8.根据权利要求5所述的斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的标记血管内皮细胞的斑马鱼品系为利用kdrl启动子驱动EGFP的表达，命名为Tg。