[发明专利]一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方法

说明书

本发明公开了一种斑马鱼中条件性诱导用于研究kdrl(vegfr2)基因在血管生长研究的方法，包括如下步骤：(1)利用非同源末端连制备kdrl条件性敲除品系；(2)利用标记血管内皮细胞的转基因品系与kdrl条件性敲除品系杂交，建立双转基因品系；(3)Cre mRNA注射至上述双转基因品系内交产生的胚胎中实现kdrl敲除，并通过荧光观察和评价血管生长的异常。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基 因敲除用于研究血管生长的方法。

背景技术

斑马鱼kdrl基因(血管生长因子受体2，vegfr2，又称flk1)对于血管发育 非常重要。针对kdrl基因，目前利用该基因的启动子可以特异标记血管内皮细 胞，说明该基因特异在血管内皮细胞中表达。通过该基因的突变品系研究，也 同样表明kdrl对血管生长的重要性(见参考文献1和2)。

目前，缺乏一种斑马鱼中条件性诱导kdrl基因敲除用于研究血管生长的方 法。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过针对kdrl基因的操作结合标记血管内皮细胞 的转基因品系，在斑马鱼中实现条件性诱导kdrl敲除来研究血管生长的方法。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明利用非同源末端连接制 备的条件性敲除kdrl的斑马鱼品系，并通过标记血管内皮细胞的转基因品系和 Cre系统在活体上研究血管的生长和发育，包括如下步骤：

(1)在斑马鱼kdrl的第12个外显子两端寻找两个核酸酶的特异识别位点， 所述的特异识别位点为sgRNA1靶点和sgRNA2靶点；

(2)构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左同源臂的核苷酸序 列和左同源臂的核苷酸序列中，左臂含有这其中一个核酸酶识别位点sgRNA1， 右臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源基因 序列，包括第12个外显子两侧的loxP位点和可用于筛选的心肌细胞标记红色荧 光蛋白；利用显微注射将核酸酶体系到斑马鱼受精卵中；将注射的受精卵培养 成鱼，通过荧光和基因型鉴定确认kdrl条件性敲除斑马鱼；

(3)利用标记斑马鱼血管内皮细胞的转基因品系与上述条件性敲除品系杂 交，通过荧光筛选获得双转基因品系；

(4)将Cre mRNA注射至上述的双转基因内交产生的胚胎中，3天后斑马 鱼胚胎用于鉴定kdrl的删除、整体表型观察和血管生长的表型观察。

进一步地，在步骤(1)中，所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸 酶。

进一步地，在步骤(2)中，所述的核酸酶体系包括Cas9蛋白或产生Cas9 蛋白的mRNA，sgRNA1和sgRNA2，kdrl敲入质粒。

更进一步地，在步骤(2)中，sgRNA1的靶点序列为：Gtaaacagtctgtgaacccc；sgRNA2的靶点序列为：Gtgagaggggtacagtacgg。

进一步地，在步骤(2)中，所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1中的第7-692位所示，所述的右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中的第 2577-3873位所示，所述的右臂之间含有需要置换的外源基因序列如SEQ ID NO：1中的第693-2576位所示。