[发明专利]检测M型磷脂酶A2受体IgG4的免疫分析试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及一种同时检测M型磷脂酶A2受体(PLA2R)不同表位决定簇自身抗体IgG4的时间分辨荧光免疫分析方法，属于临床免疫学检测领域。微孔板分别包被有经纯化的PLA2R不同表位决定簇的重组抗原，加入经稀释的待测患者血清，再加入Eu³⁺‑抗人IgG4抗体，标记免疫反应结束后，没有连接的Eu³⁺‑抗人IgG4抗体将会被洗涤除去。加入增强液后，用时间分辨荧光仪测定分别检测Eu³⁺的荧光信号，根据标准曲线得到样品中PLA2R不同表位的IgG4抗体的浓度。本发明相关的试剂盒可以同时检测PLA2R不同表位决定簇IgG4的含量，为临床应用提供便利。

技术领域

同时检测M型磷脂酶A2受体(PLA2R)不同表位决定簇自身抗体IgG4的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法，具体涉及对血清中PLA2R不同表位决定簇自身抗体IgG4含量的检测，属于临床免疫学检测领域。

背景技术

膜性肾病(membranous nephrophathy，MN)属于自身免疫性疾病，是肾病综合征的一种常见病理类型，在四十岁以上的肾病综合征患者中排第一位。其中约有80％为无明显原因引起的特发性膜性肾病(idiopathic MN,IMN)，其余为有因可循的继发性MN(SecondaryMN,SMN)。SMN常见的诱因有：系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，乙肝病毒感染，以及药物、毒物、肿瘤或环境因素等。

MN的诊断除了高尿蛋白、低血浆白蛋白这两项必要因素之外，必须依赖肾活检确诊病理类型，进而指导临床治疗，虽然肾活检作为金标准准确可靠，但具有侵入性，费用高，存在固有的医疗风险。因此，找到一种肾穿刺的替代手段、一种有助于高效诊断和监测治疗IMN的指标是近期研究的重点。2009年Beck等人发现IMN患者的肾小球足细胞上出现了M型磷脂酶A2受体(PLA2R)阳性高表达，同时患者血清中含高浓度的自身免疫性PLA2R抗体。经过十年研究总结，普遍认为PLA2R抗体是IMN已知的血清学标志物，PLA2R抗体检测是理想的、潜在可替代肾活检的有效手段。

通过对PLA2R的进一步研究，得知在IMN的发病过程中会有PLA2R抗体表位的迁移，虽然PLA2R抗原有十个结构域，但主要在CysR、CTLD1和CTLD7结构域中存在独立的表位，并且CysR是主要的免疫优势表位，这三些表位会产生相应的抗体，其中CTLD7单独表达的多肽活性不高，要与CTLD6或CTLD8同时存在，以CTLD67、CTLD78、CTLD678时会有更好的活性，见图1。通过对患者治疗的观察，IMN患者表位谱会发生改变，其中针对CysR抗PLA2R抗体的活性与良好的预后相关，而针对CTLD1和CTLD7的抗体活性与不良的预后相关。如果对能够建立一种针对PLA2R不同抗原表位的自身抗体检测方法，将对IMN患者在临床诊断、病情评估和预后分析等方面提供巨大的帮助。

近期研究发现IgG四个亚型含量在IMN和SMN中差异很大，IMN中IgG1和IgG4占主导地位，狼疮性MN中IgG1～IgG3含量较高，肿瘤相关性MN中IgG1和IgG2含量较高。Huang等人发现IMN患者中有76％的IgG亚型是IgG4，而在SMN中60％的亚型是IgG1。Beck等报导IMN患者中PLA2R-IgG4在总PLA2R-IgG占主导地位。因此，检测M型磷脂酶A2受体不同表位决定簇(CysR、CTLD1、CTLD67、CTLD78、CTLD678)自身抗体IgG4亚型将有利于IMN的鉴别诊断和判断IMN疾病的顽固程度。

近年发展的时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)，采用解离增强技术可以将荧光信号放大100万倍，与现有ELISA、CLIA检测技术相比，TRFIA技术的灵敏度高，测量范围宽，而且还具有操作简便、快速，标记物制备简便和有效期长，标准曲线剂量范围宽，不污染环境，自动化程度高，适合临床大量样品的检测等多种优点。采用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)建立检测PLA2R不同表位抗原决定簇IgG4的方法，将有助于IMN的鉴别诊断、治疗方案选择和预后评估。

发明内容