[发明专利]用于鉴别平贝母的特异性PCR鉴别引物及其应用在审
| 申请号： | 202010721055.7 | 申请日： | 2020-07-24 |
| 公开（公告）号： | CN111826460A | 公开（公告）日： | 2020-10-27 |
| 发明（设计）人： | 陈随清;杨灏;练从龙;张雪雨 | 申请（专利权）人： | 河南中医药大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司： | 郑州天阳专利事务所(普通合伙) 41113 | 代理人： | 聂孟民 |
| 地址： | 450046 河南*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 鉴别 贝母 特异性 pcr 引物 及其 应用 | ||
1.一种用于鉴别平贝母的特异性PCR鉴别引物，其特征在于，该特异性PCR鉴别引物为上游引物PB-Y1F：5' CGGGCGGACAATTTACTT 3'和下游引物PB-Y1R：5'AGATAGAGAGCGGGCGTC3'两条单链DNA分子组成的引物对，正向引物3'端最末端碱基位于122位缺失位点上，PCR扩增产物的大小为186bp。
2.一种用于鉴别平贝母的特异性PCR鉴别引物鉴别平贝母的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、平贝母总DNA的提取：按照天根快捷性植物基因组DNA提取试剂盒说明书要求提取总DNA，使用超微量紫外分光光度计对所提DNA的浓度和吸光度A260/A280进行检测，所得DNA 样本在-20℃ 条件下保存，备用；
（2）、平贝母特异性PCR条件的确定：分别取平贝母标品及平贝、青贝、松贝、炉贝、太白贝母、伊贝母、湖北贝母、浙贝母、薏苡仁的DNA样品各一批，进行PCR反应条件的确定，PCR反应条件为95℃、1min，95℃、10s，57℃、25s，30x，72℃、15s，PCR扩增反应体系为2×Taq PlusMaster Mix 12.5 μL、上游引物（PB-Y1F）1 μL、下游引物（PB-Y1R）1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9. 5 μL；
（3）、PCR反应条件优化：对PCR反应条件分别对退火温度、循环次数、DNA模板量三个因素进行试验，确定优化PCR反应条件为：2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL、上游引物（PB-Y1F）1 μL、下游引物（PB-Y1R）1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9. 5 μL，反应程序为：95℃1min;95℃10s,57℃25s,30x;72℃15s；
（4）、耐受性试验：分别使用不同保真度的Taq酶和不同型号的PCR扩增仪对优化后最佳的平贝母特异性PCR进行耐受性试验；
（5）、适用性验证：使用最终优化的平贝母特异性PCR鉴别方法对收集的29批样品进行平贝母特异性PCR鉴别方法的适用性检测；
（6）、对平贝母ITS序列上核苷酸的特性，对特异性PCR鉴别引物，在优化的反应条件下进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图上目标条带的有无进行鉴别，实现对平贝母的鉴定。
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