[发明专利]一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞为同时表达NK细胞标志物和T细胞标志物的ITNK细胞。

2.根据权利要求1所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述NK细胞标志物包括CD16、CD56、CD69、NKp46、NKp30或NKp44中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述T细胞标志物包括CD3。

3.一种如权利要求1或2所述的工程化免疫细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

(1)将gRNA与Cas9蛋白基因连接到载体上，所述gRNA的靶基因包括Bcl11b基因，得到CRISPR/CAS9基因敲除载体；

(2)通过电转化将所述CRISPR/CAS9基因敲除载体转入激活的T细胞中，培养后得到所述工程化免疫细胞。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述gRNA敲除靶基因的第二外显子、第三外显子或第四外显子中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，步骤(1)所述gRNA敲除靶基因的第二外显子和/或第三外显子；

优选地，步骤(1)所述gRNA的靶位点包括核苷酸序列GNNGG或CCNNC，所述N为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶中的任意一种；

优选地，所述N为鸟嘌呤。

5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1～17所示；

优选地，步骤(1)所述gRNA包括正向引物和反向引物；

优选地，步骤(1)所述gRNA包括SEQ ID NO.18～51所示的引物对中的任意一对或至少两对的组合；

优选地，步骤(1)所述gRNA包括如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:50和SEQ IDNO:51所示的序列。

6.根据权利要求3～5任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述电转化时CRISPR/CAS9基因敲除载体的浓度为20-50ng/μL；

优选地，步骤(2)所述电转化时激活的T细胞的浓度为(0.8～1.2)×10⁶个/mL。

7.根据权利要求3～6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述培养时使用的培养基包括T551-H3培养基；

优选地，步骤(2)所述培养的时间为10～18天；

优选地，步骤(2)所述培养时培养基中的细胞密度为(0.5～1)×10⁶个/mL。

8.根据权利要求3～7任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述采用Ficoll密度梯度离心法进行分离；

优选地，步骤(2)中所述T细胞采用磁珠分选方法进行分选；

优选地，步骤(2)中所述激活的方法为：使用包被抗人CD3、CD28和CD2的磁珠与T细胞混合孵育，得到所述激活的T细胞；

优选地，所述T细胞的细胞密度为(2～4)×10⁶个/mL，优选为2.5×10⁶个/mL；

优选地，所述混合孵育的时间为24～48h。

9.根据权利要求3～8任一项所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将gRNA与Cas9蛋白基因连接到载体上，所述gRNA的靶基因包括Bcl11b基因，得到CRISPR/CAS9基因敲除载体；其中，所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1～17所示，所述gRNA包括SEQ ID NO.18～51所示的引物对中的任意一对或至少两对的组合；

(2)采用Ficoll密度梯度离心法和磁珠分选法得到T细胞，并激活所述T细胞，并通过电转化将所述CRISPR/CAS9基因敲除载体转入激活的T细胞中，培养10～18天后得到所述工程免疫细胞。

10.如权利要求1或2所述的工程化免疫细胞在研究病毒致病机理、构建动物模型或评估病毒药物治疗效果中的应用。