[发明专利]细胞Hi-C测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种细胞Hi-C测序文库的构建方法，所述构建方法包括：

采用体积≤800μL且甲醛终浓度为1.5～2.2％的交联体系对10⁵数量级的细胞进行甲醛交联固定，得到交联细胞；

对所述交联细胞进行裂解，得到细胞核；

利用所述细胞核进行Hi-C文库构建，得到所述Hi-C测序文库；

其特征在于，对所述交联细胞进行裂解，得到细胞核包括：

采用细胞膜裂解液对所述交联细胞进行重悬后置于冰上孵育25～35min，得到细胞膜裂解物；

对所述细胞膜裂解物在0～4℃下4800～5200rpm下离心5～7min，得到细胞核沉淀物；

采用预冷的1×Cutsmart对所述细胞核沉淀物进行洗涤后置于0～4℃下4500～5200rpm离心5～7min，得到洗涤产物；

对所述洗涤产物采用终浓度为0.3～0.4％的SDS的1×Cutsmart溶液，在37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min后置于冰上放置2～3min，得到再裂解产物；

向所述再裂解产物中加入终浓度为1.5～1.8％的TritonX-100，置于37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min，得到所述细胞核；

其中，所述细胞膜裂解液包括终浓度分别如下的成分：pH 7.8～8.2，9～11mM的Tris-HCl、9～11mM NaCl、0.1～0.3％的CA-630、1×的蛋白酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用所述细胞核进行Hi-C文库构建，得到所述Hi-C测序文库包括：

采用终浓度为0.3-0.8U/μL的核酸内切酶对所述细胞核中的DNA进行酶切片段化，得到片段化DNA；对所述片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物；

对所述连接复合物进行解交联，得到解交联片段；

去除所述解交联片段中末端标记但未连接的片段，得到目标片段；

对所述目标片段依次进行末端修复加A、连接头、文库扩增及片段选择，得到所述Hi-C测序文库。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述核酸内切酶为4～6个碱基识别位点的核酸内切酶，优选所述核酸内切酶选自MboI、Dpn II、Hae III、Hind III。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，对所述片段化DNA进行生物素末端标记并连接，得到连接复合物包括：

采用终浓度为0.03～0.05U/μL的Klenow酶和终浓度为0.01～0.02mM的dNTP，对所述片段化DNA进行生物素末端标记和补平，得到标记补平产物，其中，所述dNTP包括dCTP、dGTP、d/TTP和dATP四种，其中一种带有生物素标记；

采用终浓度为3～4U/μL的T4 DNA连接酶对所述标记补平产物进行末端连接，得到所述连接复合物。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，对所述连接复合物进行解交联，得到解交联片段包括：

采用解交联体系对所述连接复合物进行解交联，得到解交联片段；

所述解交联体系包括终浓度为2～3mg/mL蛋白酶K、终浓度为0.3～0.7％的SDS及终浓度为0.9～1.1mM的EDTA。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，在采用所述解交联体系对所述连接复合物进行解交联之后，以及得到所述解交联片段之前，所述构建方法还包括：

向解交联后的产物中加入终浓度为0.48～0.53M的NaCl，然后置于60～70℃下孵育80～100min促进解交联反应，得到促解交联产物；

将所述促解交联产物置于20～30℃下放置3～6min，然后置于4800～5200rpm下离心5～7min，得到上清液；

采用磁珠对所述上清液进行纯化回收，得到所述解交联片段。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，采用0.75～0.85倍AMPure XP磁珠对所述上清液进行纯化回收，得到所述解交联片段。