[发明专利]细胞Hi-C测序文库的构建方法

说明书

本发明提供了一种细胞Hi‑C测序文库的构建方法。该构建方法包括采用体积≤800μL且甲醛终浓度为1.5～2.2％的交联体系对10⁵数量级细胞进行甲醛交联固定，然后采用优化的裂解体系及温度对交联细胞进行处理，得到细胞核悬液；对细胞核进行Hi‑C文库构建得到Hi‑C测序文库；细胞膜裂解液包括终浓度分别如下的成分：pH 7.8～8.2，9～11mM的Tris‑HCl、9～11mM NaCl、0.1～0.3％的CA‑630、1×的蛋白酶抑制剂。小体积体系对低细胞起始量固定，并优化细胞膜裂解体系及反应条件，确保细胞核的完整性，提高了细胞核DNA的量及纯度，进而提高建库效率(提高有效数据的占比)。

技术领域

本发明涉及测序文库构建领域，具体而言，涉及一种细胞Hi-C测序文库的构建方法。

背景技术

染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)是研究基因组三维结构空间互作的有利工具，近些年通过3C、4C、5C等技术延伸的Hi-C技术结合高通量测序手段可以获得全基因组三维结构的互作信息，例如常染色质与异染色质(A/B compartment)、拓扑结构域(TAD)以及染色质环(Loops)等。染色质的空间结构一直是研究的热点，基因与远端元件间的互作关系在基因表达调控和其他基因组活动中起着重要的作用。染色质相互作用的密集矩阵可用于确定染色质区域、染色体和全基因组的空间结构形态。

目前Hi-C技术已经广泛应用于生命科学和医学研究的前沿领域，常规细胞Hi-C高通量测序建库流程，首先通过甲醛固定使核内蛋白与染色质紧密结合，经过细胞裂解和四/六碱基酶对DNA的酶切后使用生物素标记的核苷酸补齐酶切产生的粘性末端；随后开始末端链接，经解交联和超声打断DNA后，利用磁珠捕获生物素标记的DNA片段，最后通过二代测序及生物信息学方法比对参考基因组，得到片段间的互作信息。

但现有的建库方法存在以下缺点：(1)常规细胞Hi-C高通量测序建库通常以10⁷个细胞进行建库，对样本量需求极大，不适用于稀缺样本建库；(2)由于建库方法的原因导致无效数据产出高，进而降低有效互作信息的数据量；(3)单次建库产出量低，无法进行高分辨率的深度测序；(4)单次建库成本高稳定性差，一旦文库构建失败，损失较大。

因此，需要对现有的细胞Hi-C高通量测序建库进行改进，降低样本起始量的同时提高测序文库的建库效率。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种细胞Hi-C测序文库的构建方法，以提高建库效率，同时降低细胞起始量。

为了实现上述目的，本发明提供了一种细胞Hi-C测序文库的构建方法，该构建方法包括：对细胞进行甲醛交联固定，得到交联细胞；对交联细胞进行裂解，得到细胞核；在细胞核内进行Hi-C文库构建，得到Hi-C测序文库；细胞为10⁵数量级的细胞，对交联细胞进行裂解，得到完整细胞核，包括：采用细胞膜裂解液对交联细胞进行重悬后置于冰上孵育25～35min，得到细胞膜裂解物；对细胞膜裂解物在0～4℃下4800～5200rpm下离心5～7min，得到细胞核沉淀物；采用预冷的1×Cutsmart对细胞核沉淀物进行洗涤后置于0～4℃下4500～5200rpm离心5～7min，得到洗涤产物；对洗涤产物采用终浓度为0.3～0.4％的SDS的1×Cutsmart溶液，在37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min后置于冰上放置2～3min，得到再裂解产物；向再裂解产物中加入终浓度为1.5～1.8％的TritonX-100，置于37℃下900～930rpm震荡裂解50～75min，得到细胞核；其中，细胞膜裂解液包括终浓度分别如下的成分：pH 7.8～8.2，9～11mM的Tris-HCl、9～11mM NaCl、0.1～0.3％的CA-630、1×的蛋白酶抑制剂。