[发明专利]一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法

说明书

本发明涉及一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，其包括S1、预冻，预冻条件为：冷阱温度≤‑80℃，气压为一个大气压，用时30～40min升温至‑55℃～‑45℃，并维持230～260min；S2、升华干燥，S2.1、一阶升华，一阶升华条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度8‑10pa，用时55～70min升温至‑35～‑30℃，并维持300～330min；S2.2、二阶升华，二阶升华条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度8‑10pa，用时30～40min升温至‑25～‑20℃，并维持1500～1600min；S3、解析干燥，解析干燥条件为：冷阱温度≤‑80℃，真空度0pa，用时60～90min升温至26～30℃，并维持400～600min，制得CRM197蛋白冻干粉。本发明具有CRM197蛋白冻干粉的各项质量与冻干前皆无明显差异，同时具有较高的稳定性的特点。

技术领域

本发明涉及疫苗冻干的技术领域，尤其是涉及一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法。

背景技术

CRM197是白喉毒素的无毒变异体，与天然白喉毒素相比，CRM197蛋白在结构上仅是A片段上第52位的甘氨酸残基被谷氨酸残基取代，从而使得其酶催化活性丧失，因而不能对细胞产生毒性作用；但由于其B片段的蛋白序列及结构未发生任何变化，没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合。即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，且其与其它多种白喉毒素及变异体相比，具有完全无毒，完整性最高、突变最少、结构最接近，受体阻断能力最强的优点。因此CRM197成为一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。

但是针对CRM197蛋白的保存，现有技术基本采用液体冻存的方式进行保存，与液体冻存前的CRM197蛋白原液降相比，其质量明显降低且稳定性不高。

现有中国专利授权公告号为：CN103627758B的专利文件公开了一种CRM197蛋白的生产方法，包括1)采用白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)进行发酵培养；2)发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理；3)经过澄清之后的发酵液用10kDa超滤膜进行超滤浓缩；4)浓缩液经硫酸铵两次盐析后对沉淀进行复溶；5)复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白；6)捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化；7)浓缩至所需浓度保存；步骤7中所述浓缩为步骤6所得的纯化后的蛋白液，采用10kDa或30kDa超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后保存方法为，加入1～5％的抑肽酶和10～20umol/LEDTA后，-20℃冻存或者加入1～5％的抑肽酶和10～20umol/LEDTA后再加入1～5％的蔗糖乳糖或麦芽糖冻干保存。

但是上述方法中并没有公开其相关冻干配方及冻干工艺，更未凸显冻干后蛋白的有效期，冻干后的CRM197蛋白冻干粉与冻干前的CRM197蛋白原液相比，其蛋白纯度明显降低。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，具有CRM197蛋白冻干粉的蛋白纯度与冻干前皆无明显差异的特点。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的冻干方法，包括以下步骤：

S1、预冻

将白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白半成品原液，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，气压为一个大气压，用时30～40min升温至-55℃～-45℃，并维持230～260min；

S2、升华干燥

S2.1、一阶升华

所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8～10pa，用时55～70min升温至-35～-30℃，并维持300～330min；