[发明专利]一种提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法

权利要求书

1.一种提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）筛选初选样品：选取食用菌的菌丝体样品与子实体样品，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，选择多糖含量最低的样品为初选样品； （2）筛选第二次筛选样品：上一步骤中筛选得到的初选样品如果是菌丝体样品，可直接用于DNA提取；筛选得到的初选样品如果是子实体样品，则对不同生长阶段的子实体进行取样，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，选择多糖含量最低的样品为第二次筛选样品； （3）筛选第三次筛选样品：根据上一步骤中筛选得到的第二次筛选样品所属的生长阶段，对该生长阶段的子实体的不同部位进行取样，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，选择多糖含量最低的样品为第三次筛选样品； （4）检验第三次筛选样品：对第三次筛选样品进行DNA提取，并进行ITS鉴定，查看DNA条带的清晰度和完整度，是否得出准确的遗传序列，以及是否达到预期效果。

2.根据权利要求1所述的提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法，其特征在于，所述总糖与多糖含量的检测包括还原糖提取及含量测定、总糖含量测定和多糖含量的计算。

3.根据权利要求2所述的提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法，其特征在于，所述还原糖提取及含量测定包括：称取食用菌相应的样品，洗净切碎后磨成浆液，然后将浆液压滤，得到滤渣；将滤渣烘干后研细，然后过筛得到筛下物为待测样品；将待测样品置于烘箱中烘干至恒重，然后依次进行粉碎和过筛；将得到的粉末包于滤纸包内，浸于烧杯中用沸水浸煮，然后多次提取获得提取液，再混合多次提取的提取液并浓缩得到浓缩液，往浓缩液中添加无水乙醇，并搅拌均匀，静置一段时间后，离心并取上清液，之后用蒽酮硫酸比色法检测上清液的还原糖含量。

4.根据权利要求2或3所述的提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法，其特征在于，所述总糖含量测定包括：用蒽酮硫酸比色法检测还原糖提取过程的所述提取液的总糖含量；所述多糖含量的计算为：总糖含量减去还原糖含量即为多糖含量。

5.根据权利要求3所述的提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法，其特征在于，所述滤渣烘干温度为80℃～85℃，所述待测样品的烘干温度为50～70 ℃，所述过筛选用80～120目筛网，所述滤纸为3～5层纱布，所述浓缩液与无水乙醇的体积比为1:3～5，所述还原糖含量和总糖含量的检测均重复2～4次，然后取平均值。

6.根据权利要求1-3之一所述的提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中，所述DNA提取采用改良CTAB法。

7.根据权利要求6所述的提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法，其特征在于，所述改良CTAB法，包括以下步骤： 1）、称取第三次筛选样品于液氨中研磨成粉末，然后将该粉末置于离心管中，再加入64-66℃预热的CTAB提取缓冲液，然后混匀，之后将离心管进行64-66℃水浴，并振荡； 2）、离心管进行离心后取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇溶液和无水乙醇； 3）、重复步骤2）； 4）、离心管进行离心后取上清液，加入乙酸钠溶液，然后加入与上清液等体积的异丙醇，充分混匀后冷冻沉淀；之后再次离心，得到DNA沉淀；然后用乙醇反复洗涤DNA沉淀，直至DNA沉淀显透明状，然后通风使乙醇挥发干净，直至DNA沉淀试管无乙醇味且DNA沉淀的表面保持湿润； 5）、往DNA沉淀试管中依次超纯水溶解DNA和RNA消化酶，之后将DNA沉淀试管进行36～38℃水浴消化； 6）、以DNA为模板，采用真菌通用引物 ITS1和ITS4扩增其ITS序列。

8.根据权利要求7所述的提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法，其特征在于，所述水浴时间为50～70小时，所述振荡频率为每隔8～12分钟一次，所述离心的转速为10000～14000 r/min，时间为8～12min。