[发明专利]一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由a：2×ddPCRSuppermix、b：无RNA酶超纯水、c：阳性对照和阴性对照、d：全血真菌总DNA提取试剂(OMEGA)组成。

其中：

a：2×ddPCR Suppermix包括：Suppermix(Bio-Rad)、FP(18um)、BP(18um)、Probe(5um)；

上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分布如下：

FP：5'-TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT-3'

BP：5'-TCTAAGGGCATCACAGACCTG-3'

Probe：FAM-TTAACCTACTAAATAGTGCTGCTAGC-BHQ1；

c：阳性对照为5314白念珠菌标准菌株，阴性对照为去离子水。

2.一种利用权利要求1所述的一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒进行的系统性真菌感染外周血检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取全血DNA

①吸取250ul全血转移至离心管；加入25ul蛋白酶A和250uL Buffer；

②65℃水浴10min；

加入260μl无水乙醇；

将溶液转移至吸附柱，进行10000g离心去滤液；

吸附柱转移到新的离心管中，添加500uL Buffer；

③10000g离心1min，弃滤液；

将吸附柱转移至新的离心管，用700ul Wash Buffer进行洗涤2次；

用100ul 65℃预热去离子水，洗脱收集DNA；

2)ddPCR检测

①将待检测样品、阴性对照和阳性对照每个组添加2×ddPCR Suppermix 14uL，分别取66ng模板DNA，用无RNA酶超纯水补齐20uL体系；

②将20uL体系转移到微滴发生卡内，制备微滴；

③将微滴转移至96孔板，进行封膜；

④将样本放入PCR仪中进行扩增，扩增条件为：

95℃反应10min、

95℃反应30s、

57℃反应1min，40个循环；

98℃反应10min；

每个步骤设置2℃/s的升降速度。

⑤将扩增完的PCR放入微滴分析仪中，检测微滴荧光信号，分析数据；

3)结果判定

利用QuantaSoft1.7.4对荧光信号进行而分析处理，划定阈值线区分阳性微球/阴性微球进行区分，其中：

阳性微球指含有真菌DNA，阴性微球指不含有真菌DNA；

4)特异性验证

为验证本发明试剂盒检测外周血真菌感染的特异性，利用本试剂盒对血液感染铜绿杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、白色念珠菌标准菌株标本进行特异性检测，结果显示，本试剂盒检测白色念珠菌感染标本为阳性，而其它细菌感染标本均显示为阴性结果。