[发明专利]一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法

说明书

本发明涉及一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法；本发明所述的一种检测外周血真菌感染的试剂盒，由a：2×ddPCR Suppermix、b：无RNA酶超纯水、c：阳性对照和阴性对照、d：全血真菌总DNA提取试剂(OMEGA)组成；本发明所述的一种检测外周血真菌感染的方法，包括以下步骤：1)提取全血DNA；2)ddPCR检测；3)结果判定。所述的一种检测外周血真菌感染的试剂盒及方法能够定性定量的检测真菌DNA拷贝，检测血液真菌具有高灵敏度及特异性。

技术领域

本发明涉及系统性真菌感染外周血真菌感染检测技术领域，尤其涉及一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法。

背景技术

随着免疫受损人群不断扩大，广谱抗生素的大量应用，侵入性技术的开展，系统性真菌感染的发病率持续增加，已引起临床高度重视。其中，对于一些高危人群的系统性真菌感染，病程进展迅速，延误诊断会贻误治疗机会，大大增加患者死亡率。因此，早期快速明确系统性真菌感染对临床医生病情诊断及治疗策略制定具有极为重要的价值。

目前，外周血培养法是系统性真菌感染的传统检测方法。但，外周血培养法耗时长、灵敏度低，仅有20-30％病例能通过外周血真菌学培养法得到诊断。外周血培养法在系统性真菌感染早期诊断中存在局限性，严重耽误疑似系统性真菌感染患者病情的诊断，因此，亟需研发快速、高灵敏度、高特异性的外周血真菌诊断技术。

数字PCR(digital PCR,ddPCR)是第三代PCR技术，其通过将PCR反应体系微滴化处理形成微滴，保证每个微滴里面包含一个或者不含有核酸模板，经过PCR扩增，利用荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数。最后根据泊松分布院里计算核酸模板的初始拷贝数。该方法比传统荧光定量方法，具有灵敏度高、精准、不易受PCR抑制物影响的有点。目前，在临床上尚未有针对外周血真菌感染的数字PCR技术方法的应用。因此，开发基于数字PCR技术快速诊断外周血真菌感染试剂盒及方法，不仅能解决现有技术的局限性，而且对外周血真菌感染患者诊断具有重要的临床价值。

为此，设计一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法，解决以上问题。

发明内容

本发明为克服以上不足，提供一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法。

一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒，由a：2×ddPCR Suppermix、b：无RNA酶超纯水、c：阳性对照和阴性对照、d：全血真菌总DNA提取试剂(OMEGA)组成；

其中：

a：2×ddPCR Suppermix包括：Suppermix(Bio-Rad)、FP(18um)、BP(18um)、Probe(5um)；

上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分布如下：

FP：5'-TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT-3'

BP：5'-TCTAAGGGCATCACAGACCTG-3'

Probe：FAM-TTAACCTACTAAATAGTGCTGCTAGC-BHQ1；

c：阳性对照为5314白念珠菌标准菌株，阴性对照为去离子水。

一种系统性真菌感染外周血检测的方法，包括以下步骤：

1)提取全血DNA

①吸取250ul全血转移至离心管；加入25ul蛋白酶A和250uL Buffer；

②65℃水浴10min；

加入260μl无水乙醇；

将溶液转移至吸附柱，进行10000g离心去滤液；