[发明专利]重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法

权利要求书

1.重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备新冠病毒COVID-19检验样品比对盘；

S2：确定样品检测方式和相应检测体系；

S3：确定及优化核酸试纸条灵敏度；

S4：试验结果分析；

S5：由试验结果分析引物组合2测序结果与COVID-19 N基因的比对结果；

S6：研究分析引物对组合2敏感性及特异性；

S7：进行引物对组合2RT RAA扩增精密性和重复性试验。

2.如权利要求1所述的重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法，其特征在于，S1中具体方法为：

2.7μg新冠病毒COVID-19 N基因全序列的重组质粒COVID-19 N pBluescript IISK(+)购自上海生工，以紫外分光光度计测量重组质粒OD₂₆₀、OD₂₈₀及OD₂₆₀/OD₂₈₀值，并重复3次，确定质粒DNA浓度和纯度，再按照公式获得质粒的拷贝数：

拷贝数＝质粒浓度×6.02×10²³/(660×质粒总长度)

计算拷贝数并稀释至1×10⁸拷贝/μL，–20℃保存备用

以1×10⁶拷贝/μL作为比对盘原液，进行10^-1×比对盘原液样本，10^-2×比对盘原液样本，10^-3×比对盘原液样本，10^-4×比对盘原液样本，10^-5×比对盘原液和10^-6×比对盘原液样本梯度稀释对比；将已定值的重组质粒稀释至1×10⁵拷贝/μL，再10倍系列稀释，获得1×10⁰拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10⁵拷贝/μL稀释液为后续扩增模板。

3.如权利要求1所述的重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法，其特征在于，S2中的具体方法如下：

S201：新冠病毒的N基因RAA扩增引物设计：以新冠病毒COVID-19N基因作为靶基因，分析新冠病毒COVID-19N基因的序列特点后，应用Primer Premier5.0软件设计种属特异性扩增引物，探针序列位于扩增引物中间区段，经四氢呋喃修饰；引物设计遵循以下原则：①扩增引物长度20-30bp，不同引物的PCR退火温度尽可能一致或相似；②扩增产物长度200-500bp，具物种特异性；③探针长度为45-60bp；使用美国国家生物技术信息中心的BLAST功能对引物扩增区段序列进行比对，完成引物扩增特异性的初步鉴定；

S202：RAA核酸扩增的电泳检测：使用Tiosbio RT RAA核酸扩增试剂盒JY0203进行RAA反应体系的配制，吸取10μL的DNA纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

S203：RAA核酸扩增试纸条检测：使用Tiosbio RT RAA核酸扩增试剂盒试纸条法JY0204进行RAA反应体系的配制，将试纸条的浸液区端插入eppendorf管，根据试纸条显色情况直接读取检测结果。

4.如权利要求1所述的重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法，其特征在于，S3中的具体方法如下：以检测时间最短的试验条件为最适条件，在S2的基础上对扩增体系进行调整，通过比较RAA核酸扩增试纸条检测体系使用的MgAc₂添加量、不同的上游引物添加量、反应时间的多个因素，确定最佳的反应体系和反应条件。

5.如权利要求1所述的重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法，其特征在于，S5中的具体方法如下：对引物组合2上游引物、下游引物扩增产物的克隆测序结果显示，该引物对测序结果与通用公司提供的质粒测序结果完全一致，显示引物组合2可以进行特异性扩增。