[发明专利]重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法

说明书

本发明公开了重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法，包括制备新冠病毒COVID‑19检验样品比对盘；确定样品检测方式和相应检测体系；确定及优化核酸试纸条灵敏度；试验结果分析；由试验结果分析引物组合2测序结果与COVID‑19 N基因的比对结果；研究分析引物对组合2敏感性及特异性；进行引物对组合2RT RAA扩增精密性和重复性试验。本发明检测体系可稳定检测初始模板低至1×10¹拷贝/μL的RAA扩增产物，且保证阴性对照无假阳性，检测结果稳定可靠，且耗时短，操作简单，大大降低了样品间交叉污染和样品降解的可能。

技术领域

本发明涉及生物科技技术领域，具体为重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法。

背景技术

目前，新冠病毒COVID-19的临床核酸检测方式主要为荧光定量PCR。荧光定量PCR技术具有速度快、灵敏度高、特异性好等优点，可准确测定样品中病原微生物数量，因而被广泛应用于病原微生物检测。但新冠病毒的定量检测方式大多需要进行前期的核酸提取和转录，不仅增加了检测步骤，延长了检测时间，而且大大增加了样品间交叉污染和样品降解的可能。

发明内容

本发明的目的在于提供重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法，操作简单，耗时短，大大降低了样品间交叉污染和样品降解的可能，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

重组酶扩增结合免疫侧流向检测新冠病毒的方法，包括以下步骤：

S1：制备新冠病毒COVID-19检验样品比对盘；

S2：确定样品检测方式和相应检测体系；

S3：确定及优化核酸试纸条灵敏度；

S4：试验结果分析；

S5：由试验结果分析引物组合2测序结果与COVID-19N基因的比对结果；

S6：研究分析引物对组合2敏感性及特异性；

S7：进行引物对组合2RT RAA扩增精密性和重复性试验。

更进一步地，S1中具体方法为：

2.7μg新冠病毒COVID-19N基因全序列的重组质粒COVID-19N pBluescript IISK(+)购自上海生工，以紫外分光光度计测量重组质粒OD₂₆₀、OD₂₈₀及OD₂₆₀/OD₂₈₀值，并重复3次，确定质粒DNA浓度和纯度，再按照公式获得质粒的拷贝数：

拷贝数＝质粒浓度×6.02×10²³/(660×质粒总长度)

计算拷贝数并稀释至1×10⁸拷贝/μL，–20℃保存备用

以1×10⁶拷贝/μL作为比对盘原液，进行10^-1×比对盘原液样本，10^-2×比对盘原液样本，10^-3×比对盘原液样本，10^-4×比对盘原液样本，10^-5×比对盘原液和10^-6×比对盘原液样本梯度稀释对比；将已定值的重组质粒稀释至1×10⁵拷贝/μL，再10倍系列稀释，获得1×10⁰拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL和1×10⁵拷贝/μL稀释液为后续扩增模板。

更进一步地，S2中的具体方法如下：