[发明专利]抗鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4的多克隆抗体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种抗鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建含有鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达，获得鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4抗原；

将所述鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4抗原进行动物免疫，获得抗血清，然后分离纯化获得抗鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，构建含有鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4基因的重组表达载体的步骤中包括：采用正向引物F1和反向引物R1扩增所述鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4基因，且正向引物F1具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物R1具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4基因包含如下核苷酸序列，或由如下核苷酸序列组成：

a)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；或

b)SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的互补序列、简并序列或同源序列；或

c)在严紧条件下与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列或其互补序列。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述同源序列与SEQ ID No.3所示核苷酸序列的同源性≥30％、或≥40％、或≥50％、或≥60％、或≥70％、或≥75％、或≥80％、或≥85％、或≥86％、或≥87％、或≥88％、或≥89％、或或≥90％、或≥91％、或≥92％、或≥93％、或≥94％、或≥95％、或≥96％、或≥97％、或≥98％、或≥99％、或≥99.1％、或或≥99.2％、或≥99.3％、或≥99.4％、或≥99.5％、或≥99.6％、或≥99.7％、或≥99.8％、或≥99.9％。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQID No.4所示。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中诱导表达的步骤中包括：

将所述重组表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中，涂布到LB固体平板上培养，然后挑选单克隆菌落接种到LB液体培养基中培养。待培养至菌液OD值为0.4-0.6时，加入IPTG诱导表达；

离心收集细菌沉淀并弃上清，加入可溶性蛋白裂解液，且将裂解后获得的细菌沉淀重悬于裂解液中；在重悬有细菌沉淀的裂解液中加入溶菌酶混匀，离心收集上清，并加入等量的5×SDS loading buffer混匀备用；

取上述上清进行SDS-PAGE电泳；

根据SDS-PAGE电泳结果选取包含有所述重组表达载体的大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞，将其置于LB液体培养中培养，待培养至菌液OD值为0.4-0.6时，加入IPTG诱导表达；

离心收集细菌沉淀并弃上清，加入可溶性蛋白裂解液、PMSF和溶菌酶重悬细菌沉淀；破碎细菌沉淀细胞并离心，取上清液保存备用；

将NTA beads与上述上清液于共同孵育，再用可溶性蛋白裂解液清洗孵育获得的杂蛋白；再对杂蛋白进行洗脱；

将洗脱的杂蛋白放入透析袋中进行透析纯化，以获得鱼类多毒物耐受蛋白MRP4/ABcc4抗原。