[发明专利]脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法在审
申请号: | 202010733939.4 | 申请日: | 2020-07-24 |
公开(公告)号: | CN111763656A | 公开(公告)日: | 2020-10-13 |
发明(设计)人: | 王广平;王知源 | 申请(专利权)人: | 深圳市人和生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0775 | 分类号: | C12N5/0775;A01N1/02 |
代理公司: | 北京捷诚信通专利事务所(普通合伙) 11221 | 代理人: | 宋安东 |
地址: | 518000 广东省深圳市南山*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 脂肪 来源 间充质 干细胞 临床 提纯 分离 培养 扩增 方法 | ||
1.一种脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.在无菌条件下,采集脂肪组织,转移至含保存液的无菌瓶内保存并冷链运输;
S2.除去血液肿胀液和破碎的脂肪组织,将脂肪组织转移至T75培养瓶中,加入洗涤液洗涤脂肪组织多次至液体清澈;
S3.向培养瓶中加入预热后的I型胶原酶消化液,摇匀放置在恒温摇床中,使脂肪充分消化,使用无菌筛网过滤除去未消化的脂肪组织,获得脂肪SVF细胞滤液;
S4.将脂肪SVF细胞滤液离心处理,得到的沉淀为脂肪SVF;
S5.弃去上清液,再加入适量洗涤液,细胞混匀,离心,再用培养液重悬离心,得到净化脂肪SVF沉淀;
S6.将净化脂肪SVF沉淀用脂肪来源间充质干细胞完全培养基重悬,按照10ml/T75瓶移入培养瓶,适量加入脂肪来源间充质干细胞完全培养基,将培养瓶放置于培养箱继续传代培养;
S7.脂肪间充质干细胞原代培养,原代培养第24小时后全量换液,去除未贴壁细胞,第5天后再全量换液,第7天得到原代脂肪间充质干细胞原代细胞;
S8.消化收获原代细胞,吸弃培养液,生理盐水洗涤,注意轻轻摇晃,在每个T75培养瓶中加入2-3ml胰酶-EDTA,常温消化,加入培养基5ml终止消化,轻轻摇晃后转移至离心管中,5ml生理盐水冲洗后转移至离心管中,定容后常温离心,加入培养基后重悬取样计数;
S9.将S8得到的细胞悬液再离心后弃去上清液,加入适量培养液重悬,轻轻摇晃,定容,按4.5×105cell/T75培养瓶,将培养瓶放置于培养箱继续传代培养;
S10.待S9中细胞融合达到80%以上时,再重复S8和S9,消化洗涤得到细胞沉淀;
S11.将S10中细胞沉淀适量重悬后,取样检测细胞量和细胞活力、细胞表型检测,离心后取上清做无菌、内毒素检测;
S12.将S11中重悬后得到的细胞沉淀加入完全培养液,重悬细胞,细胞密度为冻存密度2倍,再缓慢加入已预冷20%DMSO:80%完全培养基冻存液,混匀后转移分装到已准备好的冻存管内,封盖,贴便签,迅速转移至程序降温仪内,待温度冷却至-80℃后转移至待检库内,待检测结果合格后转移至细胞库内长期保存。
2.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法,其特征在于,所述S1中,采集脂肪组织50ml。
3.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法,其特征在于,所述S3中,向培养瓶中加入等体积浓度为0.1%-0.2%并在37℃预热后的I型胶原酶消化液,摇匀放置在恒温摇床中,在37℃、100rpm的条件下50-60min,使脂肪充分消化。
4.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法,其特征在于,所述S4中,将脂肪SVF细胞滤液常温下300g离心处理10min。
5.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法,其特征在于,所述S5中,细胞沉淀离心洗涤多次,得到净化脂肪SVF细胞沉淀;
所述S6中,将培养瓶放置于37℃、5%CO2浓度的饱和湿度培养箱进行培养。
6.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法,其特征在于,所述S8中,在每个T75培养瓶中加入2-3ml浓度为0.05%的胰酶-EDTA,常温消化1.5-2.5min;
定容后常温300g离心10min,加入培养基后重悬取样计数,重新300g离心10min;
所述S9中,将培养瓶放置于37℃、5%CO2浓度的饱和湿度培养箱进行培养。
7.根据权利要求1-6任一项所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法,其特征在于,所述保存液为60ml无血清间充质干细胞培养基,低温4℃保存。
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