[发明专利]脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法

权利要求书

1.一种脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.在无菌条件下，采集脂肪组织，转移至含保存液的无菌瓶内保存并冷链运输；

S2.除去血液肿胀液和破碎的脂肪组织，将脂肪组织转移至T75培养瓶中，加入洗涤液洗涤脂肪组织多次至液体清澈；

S3.向培养瓶中加入预热后的I型胶原酶消化液，摇匀放置在恒温摇床中，使脂肪充分消化，使用无菌筛网过滤除去未消化的脂肪组织，获得脂肪SVF细胞滤液；

S4.将脂肪SVF细胞滤液离心处理，得到的沉淀为脂肪SVF；

S5.弃去上清液，再加入适量洗涤液，细胞混匀，离心，再用培养液重悬离心，得到净化脂肪SVF沉淀；

S6.将净化脂肪SVF沉淀用脂肪来源间充质干细胞完全培养基重悬，按照10ml/T75瓶移入培养瓶，适量加入脂肪来源间充质干细胞完全培养基，将培养瓶放置于培养箱继续传代培养；

S7.脂肪间充质干细胞原代培养，原代培养第24小时后全量换液，去除未贴壁细胞，第5天后再全量换液，第7天得到原代脂肪间充质干细胞原代细胞；

S8.消化收获原代细胞，吸弃培养液，生理盐水洗涤，注意轻轻摇晃，在每个T75培养瓶中加入2-3ml胰酶-EDTA，常温消化，加入培养基5ml终止消化，轻轻摇晃后转移至离心管中，5ml生理盐水冲洗后转移至离心管中，定容后常温离心，加入培养基后重悬取样计数；

S9.将S8得到的细胞悬液再离心后弃去上清液，加入适量培养液重悬，轻轻摇晃，定容，按4.5×10⁵cell/T75培养瓶，将培养瓶放置于培养箱继续传代培养；

S10.待S9中细胞融合达到80％以上时，再重复S8和S9，消化洗涤得到细胞沉淀；

S11.将S10中细胞沉淀适量重悬后，取样检测细胞量和细胞活力、细胞表型检测，离心后取上清做无菌、内毒素检测；

S12.将S11中重悬后得到的细胞沉淀加入完全培养液，重悬细胞，细胞密度为冻存密度2倍，再缓慢加入已预冷20％DMSO：80％完全培养基冻存液，混匀后转移分装到已准备好的冻存管内，封盖，贴便签，迅速转移至程序降温仪内，待温度冷却至-80℃后转移至待检库内，待检测结果合格后转移至细胞库内长期保存。

2.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，其特征在于，所述S1中，采集脂肪组织50ml。

3.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，其特征在于，所述S3中，向培养瓶中加入等体积浓度为0.1％-0.2％并在37℃预热后的I型胶原酶消化液，摇匀放置在恒温摇床中，在37℃、100rpm的条件下50-60min，使脂肪充分消化。

4.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，其特征在于，所述S4中，将脂肪SVF细胞滤液常温下300g离心处理10min。

5.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，其特征在于，所述S5中，细胞沉淀离心洗涤多次，得到净化脂肪SVF细胞沉淀；

所述S6中，将培养瓶放置于37℃、5％CO₂浓度的饱和湿度培养箱进行培养。

6.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，其特征在于，所述S8中，在每个T75培养瓶中加入2-3ml浓度为0.05％的胰酶-EDTA，常温消化1.5-2.5min；

定容后常温300g离心10min，加入培养基后重悬取样计数，重新300g离心10min；

所述S9中，将培养瓶放置于37℃、5％CO₂浓度的饱和湿度培养箱进行培养。

7.根据权利要求1-6任一项所述的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，其特征在于，所述保存液为60ml无血清间充质干细胞培养基，低温4℃保存。