[发明专利]脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法

说明书

本发明公开了一种脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，包括以下步骤:S1.采集脂肪组织；S2.加入洗涤液洗涤脂肪组织；S3.向培养瓶中加入I型胶原酶消化液，获得脂肪SVF细胞滤液；S4.将脂肪SVF细胞滤液离心处理，得到的沉淀为脂肪SVF；S5.弃去上清液，得到净化脂肪SVF沉淀；S6.将培养瓶继续传代培养；S7.原代培养，得到原代细胞；S8.消化收获原代细胞，加入培养基后重悬取样计数；S9.将S8得到的细胞悬液再离心后弃去上清液，将培养瓶进行培养；S10.待S9中细胞融合达到80％以上时，再重复S8和S9，消化洗涤得到细胞沉淀；S11.将10中细胞沉淀取样进行检测；S12.将S11中重悬后得到的细胞沉淀加入完全培养液，待检测结果合格后转移至细胞库内长期保存。

技术领域

本发明涉及细胞生物制品技术领域，特别是涉及一种脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法。

背景技术

脂肪来源的间充质干细胞是从脂肪组织分离提纯得到的一类具有多分化潜能的干细胞，能够在一定的诱导因子作用下，分化成软骨、成骨、脂肪、神经组织及其他组织或器官。脂肪来源间充质干细胞作为应用细胞，其优点在于：1原材料来源简单，易获取；2具有间充质干细胞的特性；3对于膝关节及医美等领域的用途广泛，因此，临床上急需能够有安全质量的细胞为临床研究提供相应的技术支持。

现有的技术方法和工艺会用到动物来源成分(动物血清)和非临床级试剂(D-Hanks液等)进行细胞分离和培养，这类工艺条件不符合临床级要求，违背异源动物成分相关的伦理现实问题，对临床试验带来了不可确定的影响。

另有一些技术方法中采用的技术方法存在着脂肪组织采集部位不合理、脂肪采集保存运输环节有问题、脂肪不做清洗就消化、脂肪组织消化过度或不足、脂肪消化后只离心不过滤、脂肪消法得到的SVF成分纯度不高、培养后的脂肪来源间充质干细胞流式结果不理想等情况。如何提高脂肪来源间充质干细胞的量并提高细胞活性和细胞纯度，以保证脂肪来源间充质干细胞临床治疗时的应用安全和效果，是迫切需要解决的问题。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，通过工艺和技术方法的改进，解决脂肪来源间充质干细胞临床级生产制备的问题，满足脂肪来源间充质干细胞在临床研究的需求，提供一种脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法。

本发明的脂肪来源间充质干细胞临床级提纯分离、培养扩增和冻存方法，包括以下步骤：

S1.在无菌条件下，采集脂肪组织，转移至含保存液的无菌瓶内保存并冷链运输；

S2.除去血液肿胀液和破碎的脂肪组织，将脂肪组织转移至T75培养瓶中，加入洗涤液洗涤脂肪组织多次至液体清澈；

S3.向培养瓶中加入预热后的I型胶原酶消化液，摇匀放置在恒温摇床中，使脂肪充分消化，使用无菌筛网过滤除去未消化的脂肪组织，获得脂肪SVF细胞滤液；

S4.将脂肪SVF细胞滤液离心处理，得到的沉淀为脂肪SVF；

S5.弃去上清液，再加入适量洗涤液，细胞混匀，离心，再用培养液重悬离心，得到净化脂肪SVF沉淀；

S6.将净化脂肪SVF沉淀用脂肪来源间充质干细胞完全培养基重悬，按照10ml/T75瓶移入培养瓶，适量加入脂肪来源间充质干细胞完全培养基，饱和湿度培养箱将培养瓶放置于培养箱继续传代培养；

S7.脂肪间充质干细胞原代培养，原代培养第24小时后全量换液，去除未贴壁细胞，第5天后再全量换液，第7天得到原代脂肪间充质干细胞原代细胞；

S8.消化收获原代细胞，吸弃培养液，生理盐水洗涤，注意轻轻摇晃，在每个T75培养瓶中加入2-3ml胰酶-EDTA，常温消化，加入培养基5ml终止消化，轻轻摇晃后转移至离心管中，5ml生理盐水冲洗后转移至离心管中，定容后常温离心，加入培养基后重悬取样计数；