[发明专利]一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法

权利要求书

1.一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，包括：

1）Bmp4-sgRNA敲除载体构建及慢病毒包裹；

2）Bmp4-sgRNA敲除载体活性验证；

3）T7E1酶切检测Bmp4基因敲除效率；

4）TA克隆测序检测Bmp4基因敲除效率。

2.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，所述步骤1）：

根据NCBI官网公布的Bmp4基因的CDS区序列信息以及https://zlab.bio/guide-design-resources网站上提供的的敲除靶点设计原则设计Bmp4基因第一外显子区的3个sgRNA靶位点，并分别合成相应的寡聚单链DNA，同时设置阴性对照sg-NC序列；

接着，将寡聚单链DNA退火后形成的双链片段插入到CRISPR-Cas9敲除载体骨架PGMLV-GM1上，以构建Bmp4基因的3个敲除载体；为改善敲除载体转染效率低、作用时间短缺陷，选择阳性重组质粒进行慢病毒包裹及Lentivirus滴度测定。

3.根据权利要求2所述的一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，所述步骤2）：

为验证Bmp4基因3个sgRNA载体的敲除活性，采用两步转染法将双载体（LentiCas9-Blast和sgRNA病毒载体）转染至生长状态良好的DF-1细胞；首先转染LentiCas9-Blast，用含有杀稻瘟菌素Blast的培养基筛选2周，收集存活的细胞进行第二次转染（sgRNA），同时用Blast和嘌呤霉素Puro筛选2周。

4.根据权利要求3所述的一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，所述步骤3）：

收集筛选后的阳性细胞提取基因组，扩增Bmp4基因靶序列片段，回收PCR扩增产物进行T7E1酶切检测，通过灰度值计算基因敲除效率。

5.根据权利要求4所述的一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，所述步骤4）：

设计特异性引物扩增靶点区段序列进行TA克隆测序，计算基因敲除效率。