[发明专利]一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法

说明书

一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，属于生物技术领域。本发明通过基因编辑技术沉默基因的表达为基因功能的研究提供了重要的技术手段，RISPR‑Cas9系统属于基因编辑技术中的一种，具有敲除效率高、操作简单、成本低等优点。为此，本发明利用RISPR‑Cas9技术构建Bmp4敲除载体，不仅能够从基因组上抑制Bmp4的表达，为更准确地研究Bmp4基因在鸡原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）形成过程中的功能提供实验素材，而且也有利于为将来构建基因敲除鸡模型奠定实验基础。

技术领域

本发明涉及一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，属于生物技术领域。

背景技术

骨形成蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4,BMP4)是转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族中的一员，属于一种多功能的细胞因子。在动物体内，Bmp4由早期胚胎外胚层释放，对生殖细胞的形成和发育起着重要的调控作用。鉴于其功能，Bmp4多被作为一种细胞诱导因子，用于研究哺乳动物生殖细胞的形成和发育等过程。此外，关于Bmp4在调节哺乳动物原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)形成中的功能已较为明晰，而其在调控鸡PGCs形成中的作用机制尚不清楚。

通过基因编辑技术沉默基因的表达是探究基因功能的一种重要方法。现有的基因敲除技术主要有锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR-Cas9)系统，其中CRISPR-Cas9相较于前两种技术更为简单、高效，且成本低。因此，通过CRISPR-Cas9技术靶向敲除鸡Bmp4基因可为后续研究Bmp4在调控鸡PGC的形成过程中发挥的具体功能，以及构建基因敲除鸡模型奠定基础。

发明内容

相比于RNA干扰技术，CRISPR-Cas9技术能够实现基因组上的基因敲除，彻底阻断基因的表达，因此对基因功能的研究更为准确。鉴于此，本发明利用CRISPR-Cas9技术构建鸡Bmp4基因的敲除载体，以期在基因组上实现Bmp4基因的敲除，彻底阻断Bmp4的表达，为后续深入研究Bmp4基因在PGCs形成中的功能及基因敲除鸡模型的构建奠定基础。

本发明的技术方案如下：

通过基因编辑技术沉默基因的表达是探究基因功能一种重要方法。本课题组前期研究发现Bmp4对鸡PGCs的形成具有重要的调控作用，但具体的作用机制尚不清楚。为此，本发明设计了一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，以期为后续研究Bmp4对鸡PGCs形成的调控机制提供实验素材。具体的：

1、根据NCBI官网公布的Bmp4基因的CDS区序列信息以及https://zlab.bio/guide-design-resources网站上提供的的敲除靶点设计原则设计Bmp4基因第一外显子区的3个sgRNA靶位点，并分别合成相应的寡聚单链DNA，同时设置阴性对照sg-NC序列。接着，将寡聚单链DNA退火后形成的双链片段插入到CRISPR-Cas9敲除载体骨架PGMLV-GM1上，以构建Bmp4基因的3个敲除载体。为改善敲除载体转染效率低、作用时间段短缺陷，选择阳性重组质粒进行慢病毒包裹及Lentivirus滴度测定。

2、为验证Bmp4基因3个sgRNA载体的敲除活性，采用两步转染法将双载体(LentiCas9-Blast和sgRNA病毒载体)转染至生长状态良好的DF-1细胞。首先转染LentiCas9-Blast，用含有杀稻瘟菌素Blast的培养基筛选2周，收集存活的细胞进行第二次转染(sgRNA)，同时用Blast和嘌呤霉素Puro筛选2周。