[发明专利]一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法

权利要求书

1.一种肌钙蛋白I E13单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。

2.一种如权利要求1所述的肌钙蛋白IE13单链抗体的制备方法，其特征在于，制备步骤包括：

(1)E13单克隆细胞株总RNA提取：

取适量分泌cTnI E13单抗的杂交瘤细胞株，采用Trizol试剂法提取总RNA，再依次经氯仿萃取和乙醇洗涤后获得总RNA；通过测定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值确定RNA浓度和受蛋白污染情况；通过琼脂糖电泳观测28S/18S条带情况，确定提取的RNA完整性和DNA污染情况；

(2)E13单抗基因克隆：

采用cDNA末端快速扩增技术进行单抗基因的克隆扩增，采用商品化的RACE5’/3’试剂盒进行试验；

(3)轻重链可变区测序结果分析：

采用IMGT数据库以及NCBI数据库中的IgBLAST功能分别对轻、重链可变区基因的Sanger测序结果进行分析，包括对胚系基因同源性、开放阅读框的合理性、可变区的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)序列长度以及信号肽序列完整性等生物信息进行分析，并排除来源宿主细胞的抗体基因和假基因，最终选择完整准确的可变区基因序列进行下一步的scFv基因构建；

(4)scFv基因修饰及合成：

scFv是由抗体重链可变区VH和轻链可变区VL通过几十个氨基酸的短肽连接而成，将通过基因克隆获得的E13单抗VH和VL序列用短肽连接，在其-NH₂端添加原核分泌信号肽，在-COOH端添加定点标记和纯化短肽标签，可供后续scFv单链抗体进行生物素化或信号物质标记的定点修饰，以及进行金属螯合亲和层析的纯化标签；另外，分别在scFv基因的5’和3’端添加合适的限制性酶切位点，便于后续重组表达载体的构建，将以上基因序列合成scFv基因；

(5)scFv重组载体构建及表达：

将合成的scFv基因片段和选定的表达载体采用对应的限制性内切酶在合适温度下进行一定时间的酶切反应，采用T4 DNA连接酶在合适温度下反应一定时间进行连接，得到重组表达载体，最后将重组载体转化至合适的感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，在37℃条件下过夜培养，挑选单菌落进行PCR及酶切鉴定，对阳性克隆菌进行基因测序确认；将测序正确的scFv重组载体质粒分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂Amp-LB培养基平板，在37℃条件下过夜培养后挑取单菌落，接种至含Amp-LB液体培养基中在一定温度下进行摇床培养，当菌液生长密度达到OD600＝0.8时，加入一定终浓度的IPTG，再继续培养一定时间进行诱导表达，离心收集菌体；

(6)scFv重组表达蛋白纯化：

取适量scFv菌体重悬于缓冲液I中，超声破碎后进行离心，收集离心上清，在pure蛋白纯化系统上进行层析柱纯化，最后将含目的蛋白的洗脱液透析至缓冲液II中，收样待用；

(7)scFv片段抗体性能验证：

采用双抗夹心法验证scFv单链抗体的抗原反应性。