[发明专利]一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法

说明书

本发明首先以E13杂交瘤细胞株为原料提取总mRNA，以此为模板反转录得到cDNA，选用IgG保守区序列特异性引物扩增单抗的轻链可变区和重链可变区基因，将扩增得到的轻、重链可变区基因序列在IMGT数据库进行生物信息学分析，得到序列准确可靠的候选轻链和重链可变区基因，通过本发明的制备方法获得cTnI E13单克隆细胞株的轻重链可变区基因序列，实现以基因序列形式对E13单抗细胞株实现永久保种；并提供一种原核表达E13单链抗体的制备方法，为后续建立过程简易，成本低廉的诊断抗体原料制备工艺提供基础。

技术领域

本发明涉及肌钙蛋白I E13单链抗体的制备，具体是从E13单克隆细胞株中克隆出轻重链可变区基因，并构建单链抗体重组表达工程菌，得到能用于配制肌钙蛋白I测定试剂(免疫法)的单链抗体原料。

背景技术

据世界卫生组织统计，目前冠心病是世界十大死因中排行第一的疾病，全球每年约有1700万人死于冠心病，被称为“人类健康的第一杀手”。急性心肌梗死(acutemyocardial infarction，AMI)是造成冠心病人死亡的主要原因。AMI典型病例可以根据病史、症状及心电图的特殊改变进行诊断，但大量的临床实践发现，约有25％的AMI病人发病早期并无典型的临床症状，约50％的AMI病人缺乏心电图的特异改变，在此情况下，检测血液中的心肌损伤标志物具有重要价值。目前，肌钙蛋白I(cTnI)因在稳定性、特异性及灵敏度等方面的综合优势，已获得美国心脏协会(AHA)，美国心脏病学会(ACC)和欧洲心脏病学会(ESC)等众多权威组织的认可，逐渐成为AMI诊断的“金标准”。

临床应用的cTnI免疫检测试剂盒主要包括免疫反应体系(抗体特异性识别抗原)和信号输出体系(反应信号放大和读取方式)，其中免疫反应体系中所需的抗体质量对免疫检测系统性能起决定性作用，目前常用的cTnI抗体大多是通过杂交瘤技术制备的全长单抗，但因全长单抗制备的生产工艺流程复杂、开发周期长、投入成本高等原因，致使抗体原料成为免疫检测试剂生产成本降低的一大制约因素。另外，分泌全长单抗的杂交瘤细胞株使用几代后逐渐退化，产量降低，甚至有染色体丢失失去抗体分泌能力的风险。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种肌钙蛋白I E13单链抗体的制备方法。

本发明的目的是通过基因克隆技术获得cTnI E13单克隆细胞株的轻重链可变区基因序列，从而实现以基因序列形式对E13单抗细胞株实现永久保种；另一目的是提供一种原核表达E13单链(scFv)抗体的制备方法。

本发明的目的将通过以下技术方案实现：

1).E13单克隆细胞株总RNA提取

取适量分泌cTnI E13单抗的杂交瘤细胞株，采用Trizol试剂法提取总RNA，再依次经氯仿萃取和乙醇洗涤后获得总RNA。通过测定RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值确定RNA浓度和受蛋白污染情况；通过琼脂糖电泳观测28S/18S条带情况，确定提取的RNA完整性和DNA污染情况。具体步骤如下：

1.1)取适量杂交瘤细胞按一定比例加入Trizol试剂后，室温放置一定时间，使其充分裂解。12000g离心5min，弃沉淀；

1.2)按与加入Trizol体积的一定比例加入氯仿，振荡混匀后室温放置一定时间。4℃12000g离心15min；

1.3)吸取上层水相，至另一离心管中。按加入Trizol体积的一定比例加入异丙醇混匀，室温放置一定时间；4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；

1.4)按加入Trizol体积的一定比例加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃8000g离心5min，尽量弃上清；