[发明专利]一种小儿青翘颗粒药物在制备抗手足口病药物中的应用

权利要求书

1.一种小儿青翘颗粒药物在制备抗手足口病药物中的应用，其特征在于：所述小儿青翘颗粒药物由金银花150～160重量份，连翘150～160重量份，葛根90～110重量份，大青叶130～140重量份，山豆根60～70重量份，柴胡60～70重量份，甘草50～60重量份制备而成；所述小儿青翘颗粒药物主要用于制备抗EV71病毒药物中的应用以及在制备抗CAV16病毒药物中的应用；

所述抗手足口病药物成分包含小儿青翘颗粒药物；

所述小儿青翘颗粒药物在制备抗手足口病药物中的应用包含测试小儿青翘颗粒对手足口病EV71和CAV16病毒的抑制效果的实验方法，包括如下步骤：

1.实验材料准备；

1.1供试品与阳性药：

(1)小儿青翘颗粒干膏粉，配制方法：精确称取小儿青翘颗粒粉末4g，采用灭菌超纯水配置成100mg/ml的药液作为受试药母液，冻存于-20℃冰箱备用，用时用细胞培养液或维持液稀释成2mg/ml的起始浓度，过滤除菌后，按2倍稀释成8个系列的终浓度开展药效与毒性评价试验,所述维持液为1％胎牛血清、2μg/ml TPCK-treated胰酶、100U/ml的青霉素和链霉素混合而成；

(2)利巴韦林注射液，配制方法：精确称取原药，采用DMSO作为稀释液，将其稀释成40mg/ml的母液，储藏存于-20℃冰箱，用时用DMEM细胞维持液稀释成40μg/ml的起始浓度，然后依次按2倍稀释成8个终浓度开展药效与毒性评价试验，所述DMEM细胞维持液为1％胎牛血清、2μg/ml TPCK-treated胰酶、100U/ml的青霉素和链霉素混合而成；

(3)蒲地蓝消炎口服液，配制方法：取原研药作为受试药母液，储藏存于4℃冰箱，用时用DMEM细胞维持液按1:20稀释成起始浓度，然后依次按2倍稀释成8个终浓度；

2.实验方法；

2.1病毒毒力的测定TCID50：将不同亚型流感病毒种毒尿囊液连续作10倍梯度浓度稀释，将不同稀释度的病毒接种于Vero细胞中，于37℃吸附1h后，后换用维持液继续培养，设正常细胞对照，每稀释度4个复孔。每天在倒置显微镜下观察细胞病变，记录病变程度和孔数，将细胞病变率达50％及以上的培养孔计为病变孔，然后通过血凝试验测试细胞上清中各稀释度子代病毒的释放情况，72小时后取上清，采用甲醛固定细胞板，采用结晶紫染色再次确定各孔的细胞病变情况，最后根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50；

2.2药物对细胞毒性的测定：

上述待测定的药物临用时采用含2％血清的DMEM维持液稀释成终浓度再给药，将生长良好的细胞经胰酶消化成单个细胞后，用生长液调整至2×106/mL，按0.1mL/孔加入96孔微量细胞培养板中，过夜后，加入不同稀释度的各种药物，每稀释度4个复孔，每孔0.2mL，同时设置正常细胞对照孔，37℃5％CO2温箱培养，每日观察细胞病变，72小时后采用甲醛固定细胞，利用结晶紫染色法测定细胞病变，以不出现细胞病变CPE的药物最小稀释度为药物的最大无毒浓度TC0，按Reed-Muench法计算50％细胞毒性浓度TC50；

2.3体外抗病毒药效试验方法：

将处于对数生长期状态良好的Vero细胞，加0.25％的胰蛋白酶消化液，消化脱落后吹匀，计数，接种于96孔细胞培养板中，置恒温CO2培养箱中培养12h，分别设正常细胞对照组，病毒感染组，阳性药物对照组和受试药物组，受试药物组从最低无毒性浓度开始设置，依次做2倍稀释，做8个浓度，每浓度4个复孔，然后将上述方案加药的细胞培养板37℃下继续培养72h，观察细胞病变，待病毒对照孔细胞病变程度CPE达75％以上时，用Reed-Muench法计算样品对病毒的半数抑制浓度IC50；

2.4抗EV71病毒机制研究；

细胞培养及药物处理方法同上，收集细胞，采用QPCR方法，检测细胞炎症因子白介素IL6、肿瘤坏死因子TNF-a、白介素IL-1β、干扰素IFN-γ和趋化因子CXCL10(IP10)mRNA的表达对小儿青翘颗粒抗EV71的药效作用机制进行了探讨，具体方法如下：

2.4.1细胞RNA的提取；

弃去加药处理的细胞培养板中的细胞上清，经PBS洗涤一次后，每孔加入1mlTrizol溶液，充分吹打混匀，将样品转移至无RNase的EP管中；加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，4℃，12000rpm/min离心15min，吸取上层水相500μl至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，4℃，12000rpm/min离心10min，弃去上清，加入1ml75％乙醇，充分混匀，4℃，12000rpm/min离心10min，弃去上清，室温放置10-15min，待沉淀晾干后加入40μl的DEPC水溶解沉淀，-80℃保存备用；

3.药效作用试验结果：通过对比各组中CA16病毒TCID50测定结果判断药效。