[发明专利]一种评估温和式杀孢方法效果的方法

权利要求书

1.一种评估温和式杀孢方法效果的方法，其特征在于，该方法的步骤包括：

S1、使用萌发剂对芽孢污染物萌发处理，得到萌发芽孢污染物；

S2、使用待评估的温和式杀孢方法对所述萌发芽孢污染物进行杀菌处理，得到灭菌后的芽孢污染物；

S3、收集所述灭菌后的芽孢污染物中的芽孢并悬浮于第一悬浮介质中，得到第一悬浮液；将所述第一悬浮液进行离心处理，收集沉淀物；将所述沉淀物悬浮于第二悬浮介质中，得到第二悬浮液；

S4、使用活细胞染料对所述第二悬浮液进行第一荧光标记，得到第一标记待测产物；使用核酸探针对所述第一标记待测产物进行第二荧光标记，得到第三悬浮液；

S5、使用高灵敏度流式细胞仪对所述第三悬浮液中颗粒的400-800 nm的散射光和荧光进行检测；

其中，步骤S5中，根据所述第三悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号区分萌发后活的芽孢和其他状态的芽孢，所述其它状态的芽孢包括未萌发的芽孢和萌发后被杀死的芽孢；根据所述第三悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号区分芽孢的萌发状态；根据所述第三悬浮液中的颗粒的散射光判断杂质颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，以所述芽孢污染物的重量为基准，所述萌发剂的含量为5-100 mM。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，以所述芽孢污染物的重量为基准，所述萌发剂的含量为10-40 mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，以0.1 mL的所述第二悬浮液为基准，所述活细胞染料的浓度为1-20 μM，所述核酸探针的浓度为0.1-100 μM。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述活细胞染料的浓度为10-15 μM，所述核酸探针的浓度为1-10 μM。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述萌发剂选自营养物质和非营养化学物质中的至少一种；所述营养物质包括氨基酸、糖类、嘌呤和核苷中的至少一种；所述非营养化学物质包括阳离子表面活性剂、外源DPA和外源裂解酶中的至少一种；

所述第一悬浮介质选自磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水；所述第二悬浮介质选自磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述活细胞染料选自Calcein-AM、CFSE和BCECF-AM中的至少一种；

所述核酸探针选自SYTO 17、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62和SYTO 63中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，所述温和式杀孢方法选自加热杀菌、化学消毒剂杀菌和紫外杀菌中的其中一种；

步骤S3中，所述离心处理的条件包括：离心时间为5-20 min，离心转速为5000-10000rcf；

步骤S4中，所述第一荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为35-39 ℃，时间为10-40min，孵育完成后离心洗涤2-3次；所述第二荧光标记的条件包括：室温下避光孵育，时间为1-60 min。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述高灵敏流式细胞仪的操作方法步骤包括：

（1）使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述第三悬浮液聚焦为微米级样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；

（2）向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01-10毫秒；

（3）将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由所述探测区发出的光信号；

（4）将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；

（5）根据所述电信号对所述细菌进行区分与定量分析。