[发明专利]一种基于N端编码序列改造调控蛋白质表达的方法

说明书

本发明公开了一种基于N端编码序列改造调控蛋白质表达的方法，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明是以枯草芽孢杆菌为表达宿主，通过预测模型，评价N端编码区同义突变中，最有利于促进基因表达的核苷酸序列。通过结合超折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)的NCS的前十个氨基酸同义突变文库，测定文库中蛋白的荧光强度，选择172个代表性样本并测序鉴定，使用统计学方法建立预测模型。通过该模型优化融合了BlgS信号肽的普鲁兰酶，可使普鲁兰酶胞外酶活提高至改造前的2.67倍以及降低48％，从而为N端基因的从头设计提供理性改造的方向，有利于简易地调控基因的表达。

技术领域

本发明涉及一种基于N端编码序列改造调控蛋白质表达的方法，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

基因的突变对于改变蛋白的性质具有非常重要的意义，通常通过突变，可以从中找到性质更好的突变序列，从而提高蛋白的应用价值。基因的同义突变就是常用的一种突变手段，基因的同义突变可实现表达量相差巨大。

目前常用的方法：是通过构建同义突变文库，并结合高通量筛选策略，以期找到最佳突变体。然而这种方法耗时耗力，并且专一性强，无法用于指导其他基因的设计。尽管有的研究通过发现，合成一系列的短肽，有利于广泛提高基因的表达，然而这种方法会对酶活产生影响，由于这些促表达的短肽，占据了信号肽的位置，从而不适合于需要添加信号肽的胞外蛋白。

现有用于改善基因表达量的方法，往往都是通过非翻译区(5’UTR)的优化，然而当5’UTR模块已经足够强时，难以继续优化并显著提高表达量。而关于N端编码区(NCS)的研究较少。因此，建立一种适用于广泛基因设计的NCS改造策略非常重要。

发明内容

本发明的方法是基于对代表性样本的生物信息学分析而建立的，通过此方法，可从头设计任意基因的N端前30位碱基的核苷酸序列，对其进行同义突变。本模型的实施方案中，是通过突变引物，改变任意基因的NCS核苷酸序列为目的核苷酸序列所完成。本发明通过优化NCS的核苷酸序列，可用于指导任意基因的设计，并不需要添加额外的氨基酸序列，对蛋白质的性质降到最低。可极大的提高目的基因的表达水平。

本发明提供了一种筛选编码高表达量蛋白的核苷酸序列的方法，测定GC3和ΔG的值，再应用下述方程式计算蛋白的相对表达量，即P_sfGFP值：

P_sfGFP＝274497.657－108717.401×GC3+4886.529×ΔG。

在本发明的一种实施方式中，所述GC3为目的基因靠近ATG的N端编码区前9～10个氨基酸的同义密码子第三位碱基是GC的含量；所述ΔG为目的基因的任意启动子转录起始位点至N端编码区的第90～99bp区域间的mRNA二级结构的最小自由能。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白为能够在枯草芽孢杆菌中表达的任意蛋白。

在本发明的一种实施方式中，P_sfGFP值与蛋白的实际表达量呈正相关。

在本发明的一种实施方式中，根据P_sfGFP值筛选相应的核苷酸序列。

本发明提供了一种调控基因工程菌蛋白表达量的方法，选取目的蛋白N端编码区的长度为27～30个核苷酸，建立同义突变库；计算同义突变库中的基因的GC3和ΔG参数，根据方程计算每个核苷酸序列的相对表达量，选择具有所需表达量的核苷酸序列，将目的蛋白N端编码区进行相应突变，并将其转化到宿主细胞中；

所述方程为：P_sfGFP＝274497.657－108717.401×GC3+4886.529×ΔG。

在本发明的一种实施方式中，所述GC3为目的基因靠近ATG的N端编码区前9～10个氨基酸的同义密码子第三位碱基是GC的含量。