[发明专利]基因G20E03、其编码的蛋白及其在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用

说明书

本发明公开了一种基因G20E03、其编码的蛋白及其在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用，属于烟草抗病技术领域，其技术方案包括提供了一种基因G20E03，基因G20E03编码的蛋白，蛋白在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用及基因G20E03在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用，通过转基因技术获得基因G20E03的RNAi转基因烟草植株，在转基因烟草植株中表达基因G20E03的dsRNA，使大豆孢囊线虫基因G20E03沉默，缓解基因G20E03对烟草植株的免疫抑制作用，提高烟草植株的抗大豆孢囊线虫病性。本发明应用于烟草抗病方面，具有能够大量表达烟草大豆孢囊线虫效应蛋白基因的dsRNA，及显著抑制大豆孢囊线虫寄生的特点。通过本发明可获得强抗大豆孢囊线虫病的烟草植株。

技术领域

本发明属于烟草抗病技术领域，尤其涉及一种基因G20E03、其编码的蛋白及其在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用。

背景技术

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines，soybean cyst nematode，SCN)是植物内寄生线虫，主要侵染大豆(Glycine max)等豆科植物，烟草(Nicotiana tabacum)是其非寄主。但近年来，在山东地区发现一个特殊的能够侵染烟草的SCN群体(Tobacco population ofsoybean cyst nematode，SCNT)。利用形态学及分子生物学等鉴定手段，将山东省寄生烟草的孢囊线虫鉴定为大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)。受SCNT侵染的烟草根系，其分叉变多，后期会着生小米粒大小的白色或黄色球形颗粒(孢囊线虫的雌虫)，部分受侵染根系出现褐色坏死，最后整条根腐烂、干枯。孢囊线虫危害烟草的根系，不仅会导致烟叶产量损失和品质下降，而且会加重烟草上其他病害(如烟草枯萎病)的发生，已成为严重制约我国山东、河南等地烟区生产的重要因素之一。

目前防治孢囊线虫的方法主要有轮作、化学防治和选育抗病品种，但是由于轮作的局限性和化学防治给生态环境造成的巨大污染，以及抗线虫种质资源的匮乏，寻找高效的、可持续的大豆孢囊线虫防治方法是目前植物寄生线虫研究领域的重点。

通过基因技术获得抗病植株是防治农作物病害的有效手段，然而，由于现有技术对于SCNT的研究仅停留在对比SCN与SCNT的致病差异性上，由于SCNT特殊的致病力，使得通过基因技术筛选得到强致病因子并获得抗大豆孢囊线虫病的烟草植株仍存在很高的技术难度。

发明内容

针对现有技术存在的不足之处，本发明所要解决的技术问题是克服现有技术难点，系统运用基因技术筛选得到强致病因子并获得抗大豆孢囊线虫病的烟草植株，从而有效解决烟草病害的技术问题，提供一种能够大量表达烟草大豆孢囊线虫病效应蛋白基因的dsRNA，及有效防治烟草大豆孢囊线虫病的方法。

为解决所述技术问题，本发明采用的技术方案为：

本发明提出基因G20E03，所述基因G20E03的基因全长序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述基因G20E03的基因全长序列包括5’端非编码区、3’端非编码区和cDNA区，所述cDNA区的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述基因G20E03由以下方法克隆得到：

使用TRIZOL法提取大豆孢囊线虫烟草群体的2龄幼虫RNA，并反转录为cDNA；

根据SCNT的转录组测序结果设计引物对G20E03-part-F和G20E03-part-R，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR产物，对所述PCR产物进行纯化及T-A连接，得到连接产物，将所述连接产物转入大肠杆菌中，随机挑取单菌落，利用所述引物对G20E03-part-F和G20E03-part-R对所述单菌落进行PCR筛选，得到阳性单克隆菌落并测序；