[发明专利]一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法

说明书

本发明公开了一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，属于酶工程技术领域。该纯化方法包括以下步骤：用平衡液平衡硅胶层析填料，将赖氨酰肽链内切酶粗品上样，用平衡液再次平衡硅胶层析填料；使用流动相梯度洗脱，紫外线监测，收集主峰流出液，得到高纯度赖氨酰肽链内切酶。本发明通过一步纯化的方式将蛋白电泳纯度在60％以上的工业生产用赖氨酰肽链内切酶纯化至HPLC纯度大于95％的质谱分析用赖氨酰肽链内切酶，操作简单，且活性收率稳定在80％以上。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法。

背景技术

赖氨酰肽链内切酶(Lysyl Endopeptidase)，EC3.4.21.50，属于丝氨酸蛋白酶，其最初来源于无色杆菌和产酶溶杆菌，但表达量不高。目前，许多研究机构陆续报道采用重组表达的方式提高赖氨酰内切酶的产量。由于重组表达的固有优势，目前市面上在售的赖氨酰内切酶重组表达的比例已经越来越高。赖氨酰肽链内切酶可以特异切割肽链中赖氨酸残基或氨乙基半胱氨酸C端的肽键，能显著提高酶切转化率和纯度。因此，在胰岛素、GLP-1类似物等蛋白药物生产和蛋白质质谱分析中有着广泛的应用。在蛋白药物生产中往往只需要赖氨酰肽链内切酶产生酶切作用即可，因此其对赖氨酰内切酶的纯度要求往往不高，一般电泳纯度大于85％即可满足基本要求。但在蛋白质质谱分析中，赖氨酰内切酶中的杂质会产生质谱峰，对目的蛋白质的分析会产生极大的干扰，因此其对于赖氨酰肽链内切酶的纯度要求更高，一般要求采用HPLC方法进行分析且纯度不低于95％，如Promega公司的质谱级赖氨酰肽链内切酶。目前，无论是天然发酵还是重组表达的赖氨酰肽链内切酶我国基本都依赖进口，且未见高纯度质谱级赖氨酰肽链内切酶的制备方法报道。

CN103865836B报道采用产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)的突变菌株TGJZC-041发酵，并通过XAD1180大孔吸附纯化、S-Sepharose ff阳离子层析纯化以及超滤制备赖氨酸肽链内切酶，最终产品的电泳纯度为91％，因此无法应用于高纯度需要的质谱分析领域。CN105950593A报道了采用大肠杆菌进行重组表达制备赖氨酰内切酶，其对发酵后的蛋白通过变性、复性、激活、硫酸铵沉淀纯化、亲和层析纯化、分子筛纯化和超滤等多步反应制备重组赖氨酰内切酶，并通过酶切验证了其活性。但报道也是采用蛋白电泳进行检测，且未说明其纯化后的纯度，同时其纯化收率也只有5.4％，无法大规模产业化生产。Philip A.Kuhlman等报道了利用Lysobacter enzymogenes菌株制备赖氨酰内切酶的方法，其制备工艺同样复杂，采用了DEAE、PPA亲和纯化、反液层析纯化和ω-AminoHexyl亲和纯化四步纯化方法，但制备获得的产品纯度同样不高，且收率只有15％。申请人在前期的研究《一种新型赖氨酰肽链内切酶及其制备方法》(CN201811392504.7)中报道了采用添加标签的方式来优化赖氨酰内切酶的制备，通过添加组氨酸标签和精氨酸末端采用一步纯化的方式来实现赖氨酰内切酶的制备，但产品同样纯度不高，不适用于质谱分析领域。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可满足蛋白质谱分析的高纯度赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，通过该方法得到的赖氨酰肽链内切酶HPLC纯度高、活性收率高，工艺稳定性好，易于线性放大，适于大规模工业生产。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其包括以下步骤：

S1、用平衡液平衡硅胶层析填料，将赖氨酰肽链内切酶粗品上样，用平衡液再次平衡硅胶层析填料；所述平衡液由体积百分比为70～90％的A液和10～20％的B液组成；

S2、使用A液-B液梯度洗脱，紫外线监测，收集主峰流出液，得到高纯度赖氨酰肽链内切酶；

其中，所述A液为缓冲盐的水溶液，所述B液为三氟乙酸的有机溶液。

作为本发明优选的实施方式，所述A液中的缓冲盐浓度为1-50mM。