[发明专利]一种瘘洞修补制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种瘘洞修补制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（一）脂肪干细胞的制备

（1）脂肪干细胞的分离：取采集的脂肪组织，用生理盐水洗涤；加入适量Ⅰ型胶原酶溶液或胰蛋白酶溶液，消化；过滤，离心；吸弃细胞沉淀上层的油脂和酶溶液；用生理盐水重悬细胞沉淀，吹散，细胞过滤网，离心，吸弃上清液，得到基质血管组分细胞；

（2）脂肪干细胞的培养与传代：上述分离得到的基质血管组分细胞，进行常规培养，细胞融合度达到70%～80%时可以传代培养；收集P2或P3代细胞，进行冻存，备用；

（二）脂肪干细胞在异体真皮上的生长及培养

将上述收集的脂肪干细胞，接种到异种真皮上，生长7～14天；所述异种真皮，选自脱细胞猪皮；

（三）自体PRP的制备；

（四）瘘洞修补制剂的制备

将上述制备的PRP与交联的玻尿酸进行充分混合；将混合后的玻尿酸-PRP混合物均匀涂抹在生长有脂肪干细胞的异种真皮上，涂抹厚度为2 mm；将涂有混合物的异种真皮卷成柱状，即得瘘洞修补制剂。

2.根据权利要求1所述的瘘洞修补制剂的制备方法，其特征在于：所述洗涤的具体操作方式为：将脂肪组织置于容器中，先吸取上层黄色油脂，弃掉，再吸取下层红色液体，弃掉；向剩余的脂肪组织中加入适量生理盐水，剧烈晃动3min，以充分洗涤脂肪组织，静置3～5min，吸弃下层水相；重复洗涤脂肪组织操作三次，直至下层水相液清澈。

3.根据权利要求1所述的瘘洞修补制剂的制备方法，其特征在于：所述消化的具体操作方式为：加入酶溶液后，封口膜封口，剧烈晃动5～10s，置于气浴恒温震荡器中，在37℃、70rpm条件下，消化60min，消化过程中每隔15min剧烈晃动5～10s。

4.根据权利要求1所述的瘘洞修补制剂的制备方法，其特征在于：所述培养所用培养基为：无血清培养基或不含血清添加物的细胞培养基；培养条件为：5%CO₂、37℃。

5.根据权利要求1所述的瘘洞修补制剂的制备方法，其特征在于：所述冻存的具体操作方式为：调整细胞浓度至 2～3×10⁶个/ml，分装至细胞冻存管中，将冻存管程序降温后，转入–196℃液氮保存。

6.根据权利要求1所述的瘘洞修补制剂的制备方法，其特征在于：所述脂肪干细胞的接种密度为：10000个脂肪干细胞/cm²。

7.根据权利要求1所述的瘘洞修补制剂的制备方法，其特征在于：所述自体PRP是通过以下方法制备得到的：

（1）将采集自患者的外周血，做抗凝处理；

（2）将外周血进行离心，收集上层富含血小板的血浆；

（3）若血浆中有核细胞超过1×10⁵/ml，则进行离心，以除去大多数的有核细胞；若不超过1×10⁵/ml，则直接进行下一步；

（4）将血浆离心，以去掉大部分上层的血浆，留取少量血浆，轻轻吹散，调整血小板浓度到2×10⁹/ml；

（5）放置30min～1h并轻轻搅动，防止聚集，备用。

8.利用权利要求1～7中任一项所述的方法制备得到的瘘洞修补制剂。