[发明专利]一种11-脱氢血栓烷素B2衍生物及其制备方法与11-脱氢血栓烷素B2检测试剂

权利要求书

1.一种11-脱氢血栓烷素B2胶乳增强免疫比浊检测试剂，其特征在于，包括：J1试剂与J2试剂；

所述J1试剂由11-脱氢血栓烷素B2-多聚赖氨酸偶联物和J1缓冲液组成，所述J2试剂由抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体3包被的胶乳颗粒和J2缓冲液组成；

所述的11-脱氢血栓烷素B2-多聚赖氨酸偶联物由式Ⅰ所示的11-脱氢血栓烷素B2衍生物与多聚赖氨酸偶联而成，其结构式如式Ⅵ所示：

所述J1缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-80、丙三醇、乙二胺四乙酸、PEG-4000、叠氮钠防腐剂的磷酸钾缓冲液；

所述的抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体3为11-脱氢血栓烷素B2钥孔血蓝蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体；所述的11-脱氢血栓烷素B2钥孔血蓝蛋白免疫原，由式Ⅰ所示的11-脱氢血栓烷素B2衍生物与钥孔血蓝蛋白偶联而成，其结构式如式Ⅶ所示：

所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种；

所述胶乳颗粒为表面带有羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒，直径范围为50-450nm；

所述J2缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-80、丙三醇、乙二胺四乙酸二钠、Triton X-100、叠氮钠防腐剂的硼酸钾缓冲液；

所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：

2.一种如权利要求1所述的11-脱氢血栓烷素B2胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包含以下步骤：

(1)将浓度为0.05-2.0mg/mL的11-脱氢血栓烷素B2-多聚赖氨酸偶联物溶解于浓度为10-100mmol/L、pH值为7.0-8.0的磷酸钾缓冲液中，然后添加质量分数为0.1％-2.0％的牛血清白蛋白、0.25％-1.0％的氯化钠、0.1％-0.5％的吐温-80、1.0％-5.0％的丙三醇、0.1％-1.0％的乙二胺四乙酸、1.0％-5.0％的PEG-4000以及0.01％-0.1％的叠氮钠防腐剂，搅拌均匀，调节pH＝7.5，制成J1试剂；

(2)将质量分数为0.05-1.0％的抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体3包被的胶乳颗粒加入浓度为20-100mmol/L的硼酸钾缓冲液中，然后添加质量分数为0.1％-2.5％的牛血清白蛋白、0.25％-1.0％的氯化钠、0.1％-0.5％的吐温-80、1.0％-5.0％的丙三醇、0.1％-1.0％的乙二胺四乙酸二钠、0.1-1.0％的Triton X-100以及0.01％-0.1％的叠氮钠防腐剂，搅拌均匀，制成J2试剂；

所述的11-脱氢血栓烷素B2-多聚赖氨酸偶联物的制备方法，包含以下步骤：

a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.8-8.3，制成缓冲溶液E；

b.称取3.0-6.0mg多聚赖氨酸，0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液E中，制成多聚赖氨酸载体溶液；

c.称取3.0-8.0mg权利要求1中式Ⅰ所示的11-脱氢血栓烷素B2衍生物，0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液E中，再加入0.2-0.5ml二甲基甲酰胺，制成11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液E；

d.当上述11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液E刚变澄清时，将其逐滴加入上述多聚赖氨酸载体溶液中，然后将此混合溶液在-18～-2℃下搅拌3-10小时；

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液E进行透析，透析后所得溶液即为11-脱氢血栓烷素B2-多聚赖氨酸偶联物溶液，在11-脱氢血栓烷素B2-多聚赖氨酸偶联物溶液中加入质量分数0.05-0.20％的叠氮钠防腐剂，于-20℃下储存；

所述的抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体3包被的胶乳颗粒的制备方法，包含以下步骤：

a.将0.5-1.5mg直径为50-450nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入1.5-4.5mL、0.08mol/L、pH＝6.2的MES缓冲液中，然后加入2.5-7.5mg碳二亚胺与0.5-4.5mg N-羟基琥珀酰亚胺，在37℃下搅拌1-3小时，15000r/min离心15分钟后去除上清液，然后用15-45mL浓度为0.1mol/L、PH＝8.2的磷酸钾缓冲液将沉淀物重悬，制成胶乳颗粒溶液；

b.将0.5-1.5mg抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体3用1.5-4.5mL、0.1mol/L、pH＝8.2的硼酸钠缓冲液稀释后，立即加入到上述胶乳颗粒溶液中，在37℃下振荡反应6-24小时，然后加入1.0-3.0mL、0.1mol/L、pH＝8.5的甘氨酸缓冲液搅拌1-3小时，反应结束后加入0.5-1.5mg牛血清白蛋白，搅拌均匀后室温静置6-24小时，然后9000r/mim离心15分钟，去除上清液，再将沉淀物用10-30mL、50mmol/L、pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次，最后用15-45mL、50mmol/L、pH＝8.5的甘氨酸缓冲液将沉淀物重悬，即为抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体3包被的胶乳颗粒悬浊液；

所述抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体3的制备方法，包含以下步骤：

a.将11-脱氢血栓烷素B2钥孔血蓝蛋白免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；

b.1-4周后，再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔1-4周注射一次，共计注射3-8次；

c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗11-脱氢血栓烷素B2特异性抗体3；

所述的11-脱氢血栓烷素B2钥孔血蓝蛋白免疫原的制备方法，包含以下步骤：

a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.8-8.3，制成缓冲溶液F；

b.称取3.0-6.0mg钥孔血蓝蛋白，0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液F中，制成钥孔血蓝蛋白载体溶液；

c.称取3.0-8.0mg权利要求1中式Ⅰ所示的11-脱氢血栓烷素B2衍生物，0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液F中，再加入0.2-0.5ml二甲基甲酰胺，制成11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液F；

d.当上述11-脱氢血栓烷素B2衍生物溶液F刚变澄清时，将其逐滴加入上述钥孔血蓝蛋白载体溶液中，然后将此混合溶液在-18～-2℃下搅拌3-10小时；

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液F进行透析，透析后所得溶液即为11-脱氢血栓烷素B2钥孔血蓝蛋白免疫原溶液，在11-脱氢血栓烷素B2钥孔血蓝蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20％的叠氮钠防腐剂，于-20℃下储存；

所述的11-脱氢血栓烷素B2衍生物的合成方法，具体路线如下所示：

将100mg化合物1溶解于2mL的二甲基甲酰胺中，然后在0℃条件下加入0.1g化合物2、0.6g三乙胺以及0.12g 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，制成反应混合溶液，将此反应混合溶液在室温下搅拌过夜，反应结束后将固体物质过滤除去，并将滤液浓缩，最后将浓缩所得的剩余物通过快速柱层析法纯化，得到11-脱氢血栓烷素B2衍生物。