[发明专利]靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的猪胚胎成纤维细胞系及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的猪胚胎成纤维细胞系及其应用；本发明提供的TNFα基因敲除的sgRNA在TNFα基因上的靶点序列位于其第一外显子上，靶点序列如SEQ ID NO：1所示。在将所述sgRNA构建至载体pX330后，将表达载体pX330‑TNFα作为TNFα基因的打靶载体，转染猪胚胎成纤维细胞，获得TNFα基因敲除的猪胚胎成纤维细胞单克隆细胞株，得到的多种不同编辑类型的突变体均可造成移码突变，编辑效率较高。本发明制备得到的猪胚胎成纤维细胞细胞系可作为体细胞核移植的供体，用于转基因猪的制备，具有较大的应用研究价值。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的猪胚胎成纤维细胞系及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas系统是在大多数古生菌和多数细菌中存在的一种用于抵抗外源病毒或DNA入侵的获得性免疫系统。II型RISPR-Cas9系统是目前改造最成功、应用最广泛的，主要是通过一段短的RNA序列与DNA靶点序列按照碱基互补原则形成双链后，结合Cas9蛋白在DNA靶位点诱导形成双链断裂损伤，损伤修复时可以在基因组靶位点引入特殊的基因突变。CRISPR-Cas9系统具有设计简单，打靶效率高及能在靶位点形成多种突变的优点，目前已广泛应用于基因功能及转基因动物等的研究中。

肿瘤坏死因子TNFα(Tumor Necrosis Factor alpha)是一种促炎细胞因子，能参与正常炎症反应和免疫反应。近年的研究发现TNFα还能通过作用于生长激素/胰岛素样生长因子轴，来抑制机体生长和导致肌肉蛋白降解，可能在肌肉发育方面起负调控作用。目前对TNFα基因的研究大部分是利用抑制剂发掘其在人和小鼠中的作用，对猪源TNFα功能研究鲜有报道，而且药物阻断的特异性和有效性的很难保障，不能很好的解释基因功能，也存在一定的安全风险。

目前现有技术的抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默TNFα基因表达，因此有必要研制一种能实现沉默彻底且能长期稳定体外培养的猪TNFα基因缺失细胞株，期望通过TNFα基因缺失成纤维细胞株制备转基因猪，为免疫和炎症反应的研究提供疾病模型，同时为深入挖掘TNFα基因在猪肌肉发育方面的调控作用研究提供基础。

发明内容

为了至少解决现有技术存在的一种问题，本发明提供一种靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的猪胚胎成纤维细胞系及其应用。

第一方面，本发明提供一种靶向敲除TNFα基因的sgRNA，所述sgRNA靶点序列如SEQID NO：1所示。

本发明进一步提供编码所述sgRNA的DNA分子。

本发明进一步提供含有所述sgRNA的生物材料，所述生物材料为载体、表达盒或转基因细胞中的一种或多种。

例如，可以将所述sgRNA通过酶切连接至载体pX330上，具体方法为：

在TNFα基因的第一外显子上的靶点序列(SEQ ID NO：1)的5'端加上BbsI的酶切位点caccg，构成序列SEQ ID NO：2，并人工合成其互补序列SEQ ID NO：3，将互补序列SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3退火所形成的双链DNA分子，与经过BbsI酶切的pX330载体连接，从而构建表达载体pX330-TNFα。

第二方面，本发明提供一种敲除了TNFα基因的细胞系的构建方法，包括：

利用CRISPR-Cas9系统敲除所述细胞系的TNFα基因，所述CRISPR-Cas9系统使用的sgRNA靶点序列包括如SEQ ID NO：1所示的序列。

进一步地，所述利用CRISPR-Cas9系统敲除所述细胞系的TNFα基因中使用pX330载体。

进一步地，所述细胞系为猪胚胎成纤维细胞系。