[发明专利]一种细胞大分子锚定的DNA步移索引成像方法

权利要求书

1.一种细胞大分子锚定的DNA步移索引成像方法，其特征在于，采用杂交DNA步移探针连续切除邻近的DNA编码探针，使这些编码探针产生新的3′-OH，随后通过滚环扩增实现荧光信号放大，最终通过激光共聚焦荧光显微镜进行观察和分析，实现细胞纳米微环境中大分子锚定的DNA步移索引的成像分析；

其中，所述杂交DNA歩移探针在进行连续切除操作前已与步移阻挡探针杂交并形成双链；

所述DNA编码探针的末端序列带有硫代磷酸和索核酸修饰，该修饰能够抑制核酸被外切酶切除，无法进行3′聚合延伸；

该方法能够在细胞中实施时，包括如下步骤：

1)将细胞进行固定、透性处理后，通过一抗识别组蛋白，二抗-DNA交联探针识别结合一抗；

2)按照5-羟甲基尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶以及5-醛基尿嘧啶的识别标记顺序，通过特异性酶识别和点击化学反应分别将对应的DNA编码探针连接到上述三种化学修饰分子上；

3)加入内切酶，引发所述DNA步移探针连续切除邻近的DNA编码探针，使这些编码探针产生新的3′-OH探针；

4)通过滚环扩增实现荧光信号放大；

5)通过激光共聚焦荧光显微镜进行观察，实现细胞纳米环境内大分子锚定的多种染色质化学修饰分子的同时成像；

步骤2)具体操作如下：

通过5-HMUDK酶将带有炔基修饰的ATP结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上，随后通过点击化学反应标记编码探针-5-羟甲基尿嘧啶；

通过T4β-GT酶将带有叠氮修饰的二磷酸尿苷葡糖结合在5-羟甲基胞嘧啶位点上，随后通过点击化学反应标记编码探针-5-羟甲基胞嘧啶；

通过硼氢化钠将5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶，再通过5-HMUDK酶将带有炔基修饰的ATP结合在已被还原的5-醛基尿嘧啶位点上，随后通过点击化学反应标记编码探针-5-醛基尿嘧啶；

方法过程中涉及的序列如下所示：

‘P’和‘*’分别代表末端基团和硫代磷酸修饰。