[发明专利]一种细胞大分子锚定的DNA步移索引成像方法

说明书

本发明公开了一种细胞大分子锚定的DNA步移索引成像方法，属于属于分析化学、化学生物学及细胞成像领域。在Cell‑TALKING方法中，DNA步移探针可以连续切除邻近的DNA编码探针，使这些编码探针产生新的3′‑OH，随后通过滚环扩增实现荧光信号放大，最终，通过Cell‑TALKING方法实现细胞纳米微环境中大分子锚定的DNA步移索引的成像分析。本发明克服了无法进行多种染色质化学修饰的检测、难以区分相邻修饰分子的技术缺点。

技术领域

本发明属于分析化学、化学生物学及细胞成像领域，涉及一种细胞大分子锚定的DNA步移索引成像方法。

背景技术

细胞环境中某些分子或组分的空间分布和相互关系是生命过程的基础。染色质化学修饰已被证明在生物体中起着调控基因表达、基因组复制和染色质结构的关键作用。5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)、5-羟甲基尿嘧啶(5-hydroxymethyluracil,5hmU)和5-醛基尿嘧啶(5-formyluracil,5fU)等是哺乳动物基因组中常见的染色质化学修饰，通常与包括癌症在内的各种疾病有关。组蛋白可以进行多种翻译后修饰，特定的组蛋白修饰与活跃或沉默的基因组区域密切相关，因此其在染色质状态和基因调控中起重要作用。

在特定基因组位点或目标大分子(如修饰后的组蛋白)周围会同时存在多种染色质修饰已经被广泛证实，这暗示了他们之间存在潜在的互作关系或者空间分关系，研究这些关系将有助于阐明生物过程中的复杂表观遗传。然而现存的方法很难实现细胞纳米环境中不同生物分子的空间关系分析。

显微成像是常用的染色质化学修饰检测方法，它可以实现单个细胞内目标分子的空间定位，揭示其依赖细胞类型的分布特征以及显著的细胞异质性。现存的DNA邻近连接方法主要是通过DNA序列连接两种相邻的蛋白、基因和化学修饰。但是，单个的一对一组合在检测时会完全消耗掉探针，这使得其难以探究多种相邻染色质修饰的组合模式。综上，单细胞纳米环境内多种染色质化学修饰的同时成像分析依然是细胞成像分析领域的重大挑战。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于开发一种细胞大分子锚定的DNA步移索引成像方法(cellular macromolecules-tethered DNA walking indexing，Cell-TALKING)，结合DNA纳米技术，通过酶切核酸及链置换反应以驱动DNA步移探针，从而实现DNA编码探针的组装-解组装循环，实现多种目标物同时检测。该方法克服了无法进行多种染色质化学修饰的检测、难以区分相邻修饰分子的技术缺点。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种细胞大分子锚定的DNA步移索引成像方法，在Cell-TALKING方法中，DNA步移探针可以连续切除邻近的DNA编码探针，使这些编码探针产生新的3′-OH，随后通过滚环扩增实现荧光信号放大，最终，通过Cell-TALKING方法实现细胞纳米微环境中大分子锚定的DNA步移索引的成像分析。

其中，Cell-TALKING方法在细胞中实施时，主要包括以下步骤：

1)细胞进行固定、透性处理后，通过一抗识别组蛋白，二抗-DNA交联探针识别一抗；

2)以5hmU、5hmC以及5fU的识别标记顺序，通过特异性酶识别和点击化学反应分别将对应的DNA编码探针连接到三种化学修饰分子上；

3)杂交DNA步移探针(已提前与Walking blocker步移阻挡探针探针杂交并形成双链)；

4)加入内切酶引发DNA步移探针连续切除邻近的DNA编码探针，使这些编码探针产生新的3′-OH，随后通过滚环扩增实现荧光信号放大；

5)最后通过激光共聚焦荧光显微镜进行观察和分析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：