[发明专利]靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。本发明提供了靶向敲除FRZB基因的双sgRNA，针对FRZB基因第一外显子上两个位点进行切割，后将所述sgRNA构建至表达载体后通过优化的电转体系转染猪成纤维细胞，再利用流式细胞仪分选出高纯度的阳性单克隆细胞，经基因组鉴定筛选得到FRZB敲除的细胞系。本发明解决了构建敲除细胞系过程中转染效率、打靶效率低、单克隆纯度低的难题，操作简便且得到了较长片段删除的编辑细胞系。涉及到的细胞系可作为体细胞核移植的供体，用于转基因猪的制备，为深度挖掘FRZB基因生物学功能提供了较好的研究工具。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。

背景技术

基因敲除是研究基因功能和遗传改良的有效手段。CRISPR/Cas9是目前最常用的基因编辑系统，广泛用于基因功能和转基因动物制备等的研究中。主要原理是通过sgRNA将Cas9蛋白引导至和其序列互补的基因组区域，使得Cas9蛋白和目标基因组序列结合，进行基因组切割导致DNA双链断裂，常通过非同源末端修复的方式，在靶位点处产生一个或几个碱基的插入或缺失，以达到基因功能敲除的目的。然而，由于预测sgRNA效率的方法还不是很完善，1个sgRNA只能靶向基因的1个位点，打靶效率低，即使靶向成功，也可能因为只产生个别几个碱基的indel而不造成移码突变，不影响蛋白的功能。

FRZB(Frizzled motif associated with bone development)基因编码分泌型卷曲相关蛋白3，是Wnt的天然拮抗剂，可以通过竞争性结合调控Wnt信号途径，在特异类型细胞中调节细胞生长和分化。有研究表明，猪FRZB可能是生长性状的候选基因，在骨骼、肌肉发育和脂肪沉积中发挥调节作用，干扰FRZB能促进肌细胞的增殖、迁移和分化。因此，敲除FRZB可能使猪生长速度加快，减少脂肪沉积，增加瘦肉率，提高产量。目前，有关猪源FRZB基因功能研究的报道还很少，也没有相关基因敲除细胞系。

因此，针对Cas9系统的不足，可以通过高效的手段制备一种能实现沉默彻底且能长期稳定体外培养的猪FRZB基因缺失细胞株，期望通过FRZB基因缺失成纤维细胞株制备转基因猪，为生产FRZB基因敲除猪和深入挖掘FRZB基因生物学功能提供有利的工具。

发明内容

为了至少解决现有技术存在的一种问题，本发明提供靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。

第一方面，本发明提供一种靶向FRZB基因的双sgRNA，包括：

FRZB-sgRNA1和FRZB-sgRNA2；

所述FRZB-sgRNA1的靶向序列为：CAGCACTCAGGCCAACGCCA，(SEQ ID NO：1)

所述FRZB-sgRNA2的靶向序列为：CTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC。(SE Q ID NO：4)

进一步地，所述FRZB-sgRNA1的核苷酸序列包括：

FRZB-sgRNA1Oligo1：5'-CACCgTGGCGTTGGCCTGAGTGCTG-3'，(SE Q ID NO：2)

FRZB-sgRNA1Oligo2：5'-AAACCAGCACTCAGGCCAACGCCAC-3'；(SE Q ID NO：3)

所述FRZB-sgRNA2的核苷酸序列包括：

FRZB-sgRNA2Oligo1：5'-CACCgCCAGGCTTTCCGGCCACGAG-3'，(SE Q ID NO：5)