[发明专利]检测用新型冠状病毒核酸假病毒标准物质及其制备方法

权利要求书

1.一种新型冠状病毒核酸检测用假病毒标准物质，所述新型冠状病毒是2019-nCoV；其特征在于，标准物质中包括蛋白包裹RNA的假病毒颗粒；

所述RNA选自以下：

SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3中任选1～3个核苷酸片段；或

SEQ ID NO.4所示序列的核苷酸；

所述假病毒标准物质的制备方法，包括以下步骤：

1）通过PCR扩增将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4 所示序列的核酸克隆；

2）利用同源重组的方法，将上述克隆获得的基因连接到慢病毒表达载体，获得重组表达质粒；

3）分别将获得的重组表达质粒、假病毒包装质粒和假病毒包膜质粒转化到大肠杆菌中，进行扩增，并分别提取相应的质粒；

4）将上一步获得的重组表达质粒、假病毒包装质粒和包膜质粒共同转染至细胞后进行假病毒颗粒的包装，得到分泌在上清中包装了SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示序列RNA的假病毒颗粒；

5）收集上一步的细胞培养液上清，离心过滤后获得假病毒颗粒的粗产物；

所述假病毒标准物质的定值方法，为数字PCR法，具体操作如下：

用无RNA酶水对标准物质冻干物进行复水溶解，充分混匀后提取RNA，采用一步法逆转录数字PCR对新型冠状病毒RNA进行定量检测，实验结果以拷贝数浓度（copies/μL）表示，定值结果表示为：标准值 ± 扩展不确定度；

所述假病毒标准物质，由以下组分组成：

1）假病毒颗粒和病毒保护剂制成的假病毒冻干物；

2）用于假病毒冻干物复溶的无RNA酶水溶液；

制成所述病毒保护剂的原料组成为：海藻糖5~10重量份，牛血清白蛋白1~5重量份，蔗糖1~3重量份。

2.权利要求1所述的假病毒标准物质，所述蛋白包裹RNA，是慢病毒外壳蛋白包裹新型冠状病毒RNA。

3.权利要求2所述的假病毒标准物质，所述慢病毒的表达载体选自 pCDH、pLentilox3.7、pLKO.1、pBoBi、pLV、pLVX 或 pWPXL。

4.权利要求1所述的假病毒标准物质，将所述冻干物用无RNA酶水复溶后，其RNA浓度为1×10¹ ~1×10⁶ copies/μL。

5.权利要求1所述的假病毒标准物质，所述的制备方法步骤3）中，所述假病毒包装质粒选自pCMV-dR8.91、psPAX2、pMDLg/pRRE、pLP1 或 pNL4-3；假病毒包膜质粒选自pMD2.G、pCMV-VSV-G、pLP VSV-G或pVSV-G。

6.权利要求1所述的假病毒标准物质，所述的制备方法中，产物的纯化和后处理方法如下：

1）将假病毒颗粒的粗产物进行 DNase I 消化；

2）进行蔗糖密度梯度超速离心，收集假病毒颗粒，重悬于PBS中；

3）将假病毒颗粒的PBS溶液制备成所需浓度的假病毒溶液，加入冻干保护剂后进行冻干，得到假病毒冻干物。

7.权利要求1所述的假病毒标准物质的用途，包括以下：

1）新冠病毒核酸定性和定量检测方法的验证评价以及实验室质量控制；

2）新冠病毒核酸检测试剂研制和质量评价；

3）新冠病毒预防治疗疫苗和药物制备。