[发明专利]红嘴鸥MyD88蛋白克隆表达及多抗制备

权利要求书

1.一种红嘴鸥MyD88蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

2.一种编码红嘴鸥MyD88蛋白的基因，其特征在于：所述基因编码如权利要求1所述蛋白的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

3.一种红嘴鸥MyD88克隆表达的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）分离红嘴鸥血液淋巴细胞，提取总RNA，将RNA反转录为cDNA；

2）设计特异性引物，在上下游引物的 5’端分别插入 EcoRⅠ和XhoI酶切位点，PCR扩增获得红嘴鸥MyD88基因；

3）将pMD18-T载体与纯化的MyD88基因进行连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α进行培养，将培养后的菌液提取核酸后采用PCR及EcoR I与Xho I双酶切方法进行双重鉴定，获得重组质粒pMD18-T-MyD88；

4）用EcoR I与Xho I酶切重组质粒pMD 18T-MyD88，获得目的片段MyD88。

4.根据权利要求3所述的红嘴鸥MyD88克隆表达的方法，其特征在于：还包括以下步骤：

5）重组原核表达载体的构建

将MyD88目的片段插入pET32a(+)载体的EcoR I和Xho I酶切位点之间，构建得到重组原核表达载体pET32a-MyD88。

5.根据权利要求3或4所述的红嘴鸥MyD88克隆表达的方法，其特征在于：步骤2）中，特异性引物序列如下：

上游引物F：5’- GAATTCATGGGCACGGCGCCGGCG-3’；

下游引物R：5’- CTCGAGTCATGGCAGCATGAGGGAT-3’；扩增片段长度为921bp。

6.根据权利要求3-5任一项所述的红嘴鸥MyD88克隆表达的方法，其特征在于：步骤2）中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；95℃变性50s，56℃退火50s，72℃延展50s，30个循环；72℃ 延展10min。

7.一种红嘴鸥MyD88蛋白的制备方法，其特征在于：将权利要求4、5或6制备的红嘴鸥MyD88原核表达载体转化至Transetta DE3表达宿主菌中，经IPTG诱导表达，获得红嘴鸥MyD88重组蛋白。

8.根据权利要求7所述的红嘴鸥MyD88蛋白的制备方法，其特征在于：菌液OD₆₀₀值约0.5-0.6时，诱导表达条件为加入1 mmol/l IPTG于37℃条件下诱导表达5h。

9.一种红嘴鸥MyD88多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求1-8任一项获得的红嘴鸥MyD88蛋白作为抗原免疫兔子，接种方法如下：

1）免疫原的准备：用纯化、超滤浓缩后重组蛋白与弗氏佐剂等体积，冰浴超声乳化（超声7s，停3s），直至乳化后的抗原滴于水中呈滴状浮于水面上，且10min内不扩散；

2）免疫程序：一免：弗氏完全佐剂+抗原，抗原剂量1mg/只（0.8 mg/mL），足底皮内接种；首免后一周，进行二免：不完全佐剂+抗原，抗原剂量1mg/只（0.6 mg/mL），腹部皮内、背部皮下接种；首免后二周，进行三免：不完全佐剂+抗原，抗原剂量1mg/只（0.6 mg/mL），背部、腹部皮下接种；

3）三免结束后两周颈动脉放血，分离血清即可得多克隆抗体。

10.一种红嘴鸥MyD88多克隆抗体，其特征在于：该多克隆抗体根据权利要求9的方法制备得到。