[发明专利]一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，Mutyh基因的CRISPR/Cas9系统，设计并体外转录gRNA，同时对Mutyh基因进行flox修饰，构建同源重组载体；

条件性敲除小鼠Mutyh基因的CRISPR/Cas9系统，Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，gRNA作用位点的DNA序列为（SEQ NO.1）5'—CTAAGATCAGAAATTTGGTC—3'和（SEQ NO.2）5'—TGAGTAGCTTCCTTCAGCTT—3'。

2.根据权利要求1所述的一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于，所述gRNA作用位点位于Mutyh基因的3-15号外显子的两侧。

3.根据权利要求2所述的一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于，所述同源重组载体的构建，是对Mutyh基因进行flox修饰，flox修饰位点的DNA序列为（SEQ NO.3）5'—ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT—3'和（SEQ NO.4）5'—ATAACTTCGTATAATGT ATGCTATACGAAGTTAT—3'。

4.根据权利要求1所述的一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于，所述Mutyh基因进行flox修饰，flox与特异性的Cre结合后，能条件性敲除Mutyh基因第3-15外显子。

5.根据权利要求2所述的一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统和同源重组载体在制备Mutyh基因条件性敲除的细胞系中应用。

6.根据权利要求3所述的一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统和同源重组载体转染细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为Mutyh条件性敲除的细胞系。

7.根据权利要求5所述的一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于，所述细胞系在制备Mutyh条件性基因敲除小鼠模型中应用。

8.根据权利要求2所述的一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于，操作步骤包括：

1）基于CRISPR/Cas9系统设计靶向Mutyh基因的gRNA; 同时对靶基因进行flox修饰，构建同源重组载体；

2）将 Cas9、gRNA、同源重组载体同时注射到小鼠的受精卵中；

3）将受精卵移植到假孕母鼠体内，产出FO代，对FO代进行PCR鉴定；

4）将阳性FO代与野生型小鼠交配获得F1代杂合子；

5）将 F1 代杂合子与特异性Cre工具鼠配繁，得到flox区域删除且 Cre 阳性的小鼠后，再和野生型背景鼠交配得到flox区域删除且Cre阴性的小鼠，待这些小鼠性成熟后兄妹配繁，后代得到去除flox区域且Cre阴性的纯合子，获得基因组织和细胞特异性敲除的模型小鼠。

9.根据权利要求8所述的一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法,其特征在于，用于PCR鉴定的特异性引物包括：

（SEQ NO.5）Mutyh—F1：5'—TAGGGATGCCCCTTGCATAGTA—3'

（SEQ NO.6）Mutyh—R1：5'—ACAATCTGTTCCCACTCAGGGC—3' 和

（SEQ NO.7）Mutyh—F2：5'—AGGCTTGCTGTGAACCAAGGA—3'

（SEQ NO.8）Mutyh—R2：5'—CCAACTGACCTTGGGCAAGAACAT—3' 和

（SEQ NO.9）Mutyh—F3：5'—TCTGAGGCGGAAAGAACCAG—3'

（SEQ NO.10）Mutyh—R3：5'—TCTTCCAGCCTCAATGGGCAC—3'。