[发明专利]一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法

说明书

本发明公开一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对Mutyh基因进行flox修饰，该flox小鼠与特异性的Cre工具鼠交配后，可敲除Mutyh基因第3‑15外显子，获得基因组织或细胞特异性敲除的模型小鼠，MUTYH基因变异可能通过诱导线粒体功能障碍，成为能量代谢障碍相关疾病发生的风险因素，心肌能量代谢障碍是导致并促进心力衰竭的发生发展的重要因素。本发明Mutyh基因条件性敲除小鼠模型稳定性好，为进一步研究心力衰竭的发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型。

技术领域

本发明涉及一种小鼠模型的构建方法，具体是一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术

慢性心力衰竭是各种心血管疾病发展的最终结局，临床上以心功能减退和各种心律失常为主要特点。心脏病理性重构是各种心血管疾病进展为慢性心力衰竭最重要的病理生理基础，如何预防心脏病理性重构是各种心血管疾病治疗的关键和难点。

线粒体是心肌细胞能量产生的主要场所。线粒体持续应激，产生氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，引起线粒体DNA(mtDNA)和线粒体蛋白质的氧化损伤；ROS增高进入恶性循环，将导致细胞内异常mtDNA和受损线粒体的累积，而可能导致心肌细胞能量代谢失调，促进心脏病理性重构及心力衰竭发生发展；但其确切的分子机制尚未完全阐明，因而缺乏有效的干预靶点。

MUTYH定位于1p34.3-32.1，全长约11.2kb，含16个外显子，编码A/G特异性腺嘌呤DNA糖基化酶。MUTYH蛋白的主要功能是通过切除与DNA链中氧化损伤碱基8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)错配的腺嘌呤，消除氧化损伤可能导致的G→T的突变，实现对氧化损伤的修复，维持基因组的稳定性。MUTYH主要产生α转录子和β转录子，α转录子具有基因的全编码序列，翻译产生该基因的1型肽链(MUTYH 1,CCDS41320.1)，包含线粒体定位序列，主要定位于线粒体；β转录子缺少MUTYH的Exon1序列，起始密码在Exon2内，其翻译的肽链(MUTYH2,CCDS41322.1)缺乏线粒体定位序列，定位于细胞核。MUTYH1和MUTYH2分别参与mtDNA和核基因组的氧化损伤修复，其功能障碍将导致基因组稳定性降低。MUTYH变异是能量代谢障碍相关疾病发生的风险因素，但迄今为止，对Mutyh基因表达产物的功能及基因突变导致心力衰竭的分子机制仍未阐明。

因此，利用Mutyh基因条件性敲除动物模型研究心力衰竭能为人类心力衰竭疾病的诊断、治疗提供理论基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对Mutyh基因进行flox修饰，该flox小鼠与特异性的Cre工具鼠交配后，可敲除Mutyh基因第3-15外显子，获得基因组织和细胞特异性敲除的模型小鼠，Muthy基因变异可能通过诱导线粒体功能障碍，成为能量代谢障碍相关疾病发生的风险因素，心肌能量代谢障碍是导致并促进心力衰竭的发生发展的重要因素，Mutyh基因条件性敲除小鼠模型，稳定性好，为进一步研究心力衰竭的发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，所述Mutyh基因的CRISPR/Cas9系统，设计并体外转录gRNA，同时对Mutyh基因进行flox修饰，构建同源重组载体(Donorvector)。

进一步地，所述条件性敲除小鼠Mutyh基因的CRISPR/Cas9系统，Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，gRNA作用位点位于Mutyh基因的3-15号外显子的两侧，gRNA作用位点的DNA序列为(SEQ NO.1)5'—CTAAGATCAGAAATTTGGTC—3'和(SEQNO.2)5'—TGAGTAGCTTCCTTCAGCTT—3'。