[发明专利]一种治疗肝癌的含IL12双顺反子的病毒构建体及其用途和构建方法

权利要求书

1.一种治疗肝癌的病毒构建体，其以有效连接的方式包含：

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的AFP启动子、

(b)RGD-4C基因、

(c)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的IL-12-p40基因、

(d)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的IRES基因、和

(e)核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的IL-12-p35基因。

2.权利要求1的病毒构建体，其中(b)RGD-4C基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.权利要求1的病毒构建体，其为腺病毒构建体。

4.权利要求1的病毒构建体，其还包含(f)谷氨酰转肽酶基因和肿瘤相关抗原基因。

5.权利要求1-4中任一项的病毒构建体，其以5’至3’的方向包含组件(a)、(b)、(c)、(d)、(e)以及任选的(f)。

6.权利要求1-5中任一项的病毒构建体在制备用于在患者中治疗癌症的药物中的用途。

7.权利要求6的用途，其中所述癌症是肝癌，例如肝细胞癌。

8.一种构建权利要求1-5中任一项的病毒构建体方法，其特征在于，包括以下步骤：

将增加病毒复制的RGD-4C基因和增强细胞免疫调节作用的IL-12-p40基因、IRES基因和IL-12-p35基因有效连接到腺病毒表达载体上，和将腺病毒载体上的CMV启动子置换成肝癌启动子AFP启动子，从而构建成溶瘤病毒表达载体Adv-Ade^{AFP+RGD-4C+p40-IRES-p35}。

9.一种构建权利要求1-5中任一项的病毒构建体方法，其特征在于，包括以下步骤：

任选地(1)构建Ade-PDC316-CMV-GFP质粒：设计含有HindⅢ-GFP正向扩增引物，和SalⅠ-GFP反向扩增引物,从PSMPUW-GFP扩增带有HindⅢ/SalⅠ双酶切位点的GFP目的基因，同时使用HindⅢ/SalⅠ双酶切Ade-PDC316-CMV载体，连接获得质粒Ade-PDC316-CMV-GFP；

(2)构建Ade-PDC316-CMV-IRES质粒：设计含有EcoR Ⅰ-IRES-F的正向扩增引物和HindⅢ-IRES-R的反向扩增引物，自PSMPUW-IRES-GFP扩增引入带有EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的IRES基因片段，并使用EcoR Ⅰ/HindⅢ酶切IRES基因片段和Ade-PDC316载体，连接后构建质粒Ade-PDC316-CMV-IRES；

(3)构建Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES质粒：设计含有EcoR Ⅰ-IL-12-p40-F的正向扩增引物和EcoR Ⅰ-IL-12-p40-R的方向扩增引物，自NK细胞的cDNA扩增含有酶切位点的EcoR Ⅰ的IL-12-p40目的基因，然后分别使用EcoR Ⅰ单酶切EcoR Ⅰ的IL-12-p40目的基因和Ade-PDC316-CMV-IRES载体，连接验证顺序后构建质粒Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES；

(4)构建Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35质粒：设计含有HindⅢ-IL-12-p35-F的正向扩增引物和HindⅢ-IL-12-p35-R的反向扩增引物，自NK细胞的cDNA扩增含有酶切位点的HindⅢ的IL-12-p35目的基因，然后分别使用HindⅢ单酶切IL-12-p35目的基因和Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES载体，连接验证顺序后构建质粒Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35；

任选地(5)构建Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GFP质粒：使用EcoR Ⅰ/HindⅢ酶切Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35和Ade-PDC316-CMV-GFP载体，连接后构建质粒Ade-PDC316-CMV-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GFP；

(6)构建Ade-PDC316-CMV-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35质粒：设计含有RGD-4C序列的EcoR Ⅰ-RGD-4C-IL-12-p40-F的正向扩增引物，使用此正向扩增引物和HindⅢ-IL-12-p35-R的反向扩增引物，以Ade-PDC316-CMV-RGD-4C IL-12-p40-IRES-IL-12-p35做模板扩增引入RGD-4C目的基因，扩增后使用EcoR Ⅰ/HindⅢ酶切RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35目的基因和载体Ade-PDC316-CMV-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35，连接后构建质粒Ade-PDC316-CMV-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35；

任选地(7)构建Ade-PDC316-CMV-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GFP质粒:使用EcoR Ⅰ/HindⅢ酶切载体Ade-PDC316-CMV-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35和载体Ade-PDC316-CMV-GFP，连接后构建质粒Ade-PDC316-CMV-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GFP；

(8)构建Ade-PDC316-AFP-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35质粒:合成带有Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的人源AFP启动子，并使用Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切AFP基因片段和Ade-PDC316-AFP-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35载体，使用人源AFP启动子替换CMV启动子，优选使用T4 DNA连接酶连接后，构建质粒Ade^{AFP+RGD-4C+IL-12-p40-IRES-IL-12-p35}；

任选地(9)构建Ade-PDC316-AFP-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GFP质粒:合成带有Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的人源AFP启动子，并使用Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切AFP基因片段和Ade-PDC316-CMV-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GFP载体，使用人源AFP启动子替换CMV启动子，优选使用T4 DNA连接酶连接后，构建质粒Ade^{AFP+RGD-4C+IL-12-p40-IRES-IL-12-p35+GFP}；和

任选地(10)将谷氨酰转肽酶基因和肿瘤相关抗原基因连接到Ade^{AFP+RGD-4C+IL-12-p40-IRES-IL-12-p35}，从而构建Ade-PDC316-AFP-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GT-TAA质粒。