[发明专利]一种治疗肝癌的含IL12双顺反子的病毒构建体及其用途和构建方法

说明书

本申请涉及一种治疗肝癌的病毒构建体及其用途和构建方法。本发明还涉及一种个体化靶向治疗肝癌新型溶瘤病毒及其构建方法。本发明的构建体以有效连接的方式包含AFP启动子、RGD‑4C基因、IL‑12‑p40基因、IRES基因和IL‑12‑p35基因以及任选的谷氨酰转肽酶基因和肿瘤相关抗原基因。

技术领域：

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体的说，本发明涉及一种治疗肝癌的含IL12双顺反子的病毒构建体及其用途和构建方法。本发明还涉及一种个体化靶向治疗肝癌新型溶瘤病毒及其构建方法。

背景技术：

肝癌指的是肝脏的恶性肿瘤，一般分为两大类：即原发性肝癌和继发性肝癌两大类。原发性肝癌起源于肝脏的上皮或间叶组织，在我国属于高发性癌症；相比较原发性肝癌，继发性或转移性肝癌主要指已转移身体各个器官的肿瘤入侵至肝脏的癌症。诱发肝癌的原因很多，如乙型与丙型肝炎病毒的感染，饮用水污染、化学物质致癌、免疫失调以及其他复杂因素等。目前对于癌症的治疗主要有以下几种手段：手术治疗、姑息性外科治疗、多模式综合治疗、无水酒精瘤内注射、放射治疗、导向治疗、肝动脉栓塞化疗、放疗和生物治疗等。其中生物治疗是目前除手术、化疗、放疗外的第四大肝癌治疗方法。但是生物治疗的手段屈指可数，其中的免疫治疗方法，通过分离抗癌免疫细胞，进行体外培植再回注到患者体内，达到自身免疫的效果；还有用于肝癌的靶向药物，如2016年5月通过FDA审核的乐伐替尼已经作为肝癌全身治疗的一线用药。乐伐替尼的主要靶点有VEGFR-1、 VEGFR-2、VEGFR-3、FGFR1、PDGFR、cKit、Ret，通过抑制肿瘤生成和抑制血管形成等细胞活动抑制肿瘤发生发展。根据临床效果显示乐伐替尼的有效率为24％，中位无进展生存期为7.4个月，中位总生存期为13.6个月。尽管如此，肝癌的死亡率在全球范围内依旧居高不下，研究更为有效的肝癌治疗方法是立在必行的方向。

白细胞介素12(interleukin-12,IL-12),又称自然杀伤细胞刺激因子 (NKSF)或细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLM F),它具有众多的生物学功能,尤其在肿瘤免疫治疗方面显示毒副作用小,抗肿瘤生成及转移活性高,有望开发成治疗肿瘤的新药(唐冬生等，1999),IL-12是一种重要的参与免疫调节的细胞因子,它主要是由巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子，双亚基必须同时在一个哺乳细胞内表达才能产生有完整生物学活性的IL-12。IRES为微小RNA病毒类中5'端非翻译区中的一段序列,它可直接引入核糖体大小亚基对其后的结构基因进行翻译。IRES这一特点,可应用于构建同时表达两个基因的双顺反子真核表达载体,尤其在进行IL-12的真核表达时, IRES的应用更有意义,因为形成具有完整的生物学功能的IL-12需要p40和 p35双亚基等分子数表达,如果p40过量表达,游离p40形成p40同亚基二聚体, 它是IL-12的抑制剂,拮抗IL-12的生物学活性,下调机体的细胞免疫作用, 所以用IRES串联p40和p35亚基进行IL-12的真核表达可有效获得重组 IL-12(高军，2004)。

甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)是一种主要在肝癌细胞表达的分泌蛋白，本发明利用肝癌特异性表达AFP的特点构建靶向在肝癌细胞感染繁殖的新型溶瘤病毒Ade-PDC316-AFP-RGD-4C-IL-12-p40-IRES-IL-12-p35-GT-TAA，该病毒不感染正常肝细胞及其它正常组织，靶向用药，具有高效/特异性强等特点，该病毒同时具有增加病毒复制和调节增加细胞免疫等特点。

溶瘤病毒疗法是一种通过病毒选择性感染肿瘤细胞来杀伤肿瘤的新型肿瘤治疗方法。溶瘤病毒是具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，但这种病毒对正常细胞不造成影响，其主要通过刺激机体残生特异性肿瘤免疫反应杀死肿瘤。目前溶瘤病毒主要分为两大类，一类是天然对于肿瘤细胞具有特异性感染或杀伤能力的病毒，如呼肠孤病毒，新城疫病毒等；另一类是经过人工改造过的，对肿瘤具有特异性杀伤能力并在肿瘤中复制的病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒和人牛痘病毒等。