[发明专利]一种基于二代测序技术检测BRCA1和BRCA2突变的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于二代测序技术检测BRCA1和BRCA2突变的方法及试剂盒，属于分子检测技术领域。为了克服现有技术在检测BRCA1和BRCA2时，未能实现基因的全部覆盖的技术不足，本发明提供基于二代测序技术检测BRCA1和BRCA2突变的方法及试剂盒，该方法中通过将待测基因打断后加上A接头，进行相应PCR反应后使用设计的探针进行杂交捕获，将捕获后的DNA文库进行扩增后进行文库测序后使用软件进行评估即可确定BRCA1和BRCA2突变。该方法相对于现有技术实现BRCA1和BRCA2全基因覆盖，数据结果可靠，适宜进行推广。

技术领域

本发明涉及一种基于二代测序技术检测BRCA1和BRCA2突变的方法及试剂盒，属于分子检测技术领域。

背景技术

同源重组(Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组可以使受损的染色体通过与另一条未受损染色体的相同DNA进行自身的修复，这种修复保证了基因组的完整性。当细胞出现同源重组基因突变，导致同源重组缺陷(homologous recombinationdeficiency，HRD)时，细胞不能通过同源重组的方式对DNA进行自身修复。比如我们熟知的乳腺癌肿瘤相关基因BRCA1和BRCA2就是同源重组蛋白。当个体的BRCA1和BRCA2两基因发生突变时，其乳腺癌终生风险为87％，患卵巢癌的风险也超过40％，而且会导致发病年龄提前。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase，PARP)是一种DNA修复酶，在DNA修复通路中起关键作用。DNA损伤断裂时会激活PARP，它作为DNA损伤的一种分子感受器，具有识别、结合到DNA断裂位置的功能，进而激活、催化受体蛋白的聚ADP核糖基化作用，参与DNA的修复过程。因此，PARP抑制剂是一种靶向聚ADP核糖聚合酶的癌症疗法，它能将导致同源重组修复功能缺陷的肿瘤细胞发生合成致死，但不影响正常细胞，由此产生高选择性抗肿瘤作用。研究发现携带BRCA突变的肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感度高。

同源重组修复通路非常复杂，其突变的检测存在一定难度，因此建立准确、可靠、灵敏的检测方法具有十分重要的意义。但目前的BRCA1和BRCA2检测方法中未能实现基因的全部覆盖，当前的检测方法未考虑同源重组基因的内含子区域，更没有考虑BRCA1和BRCA2上的其他基因。如在检测BRCA1、BRCA2基因突变的方法中，同源重组修复基因的靶向测序主要涉及BRCA1、BRCA2基因的外显子区域，并没有考虑到BRCA1、BRCA2的内含子区域以及通路上的其他基因。BRCA1、BRCA2的外显子长度40nt到4931nt之间，内含子长度在92nt到14544nt之间。BRCA1、BRCA2上长度小于50nt的大片段缺失已经证明可以影响BRCA1、BRCA2的正常功能。对于长度较短且两侧内含子过长的外显子，捕获整个基因优于仅捕获外显子区域，增加了检测的准确性。另外研究表明BRCA1和BRCA2上的ATM基因具有细胞周期阻滞以及DNA损伤后修复的功能，ATM蛋白已经成为PARP抑制剂的靶点之一。RAD51产生的蛋白与单链和双链DNA结合，催化同源DNA间的识别和链交换，在同源重组修复过程中发挥重要功能。RAD51foci无法形成是同源重组修复通路失效细胞的特征之一。每一个同源重组修复基因失效都有可能导致基因组不稳定的发生。

基于此，本发明提供一种基于二代测序技术检测BRCA1和BRCA2突变的方法及试剂盒。

发明内容

现有技术在检测同源重组修复通路基因的突变时存在如下不足：

1.现有技术在检测BRCA1/2时，未能实现基因的全部覆盖，主要涉及BRCA1/2两个基因的外显子区域，并没有考虑到BRCA1/2的内含子区域。

2.现有产品没有加入突变特征作为辅助判断同源重组修复通路功能活性的方法。

3.现有产品没有加入双等位基因致病突变负荷的计算，因此造成灵敏度较低，特异性较差。