[发明专利]一种生产腐胺的工程菌及方法

说明书

本发明公开了一种生产腐胺的工程菌及方法，属于生物工程技术领域。本发明通过对腐胺合成途径中相关的精氨酸脱羧酶和胍基丁胺脲水解酶进行改造，获得了能够解除反馈抑制并提升酶活的两个突变体，利用所述突变体构建了基因工程菌用于腐胺的生产，在全细胞转化条件下，以精氨酸为底物，腐胺产量能达到120g/L及以上。利用两种酶的突变体进行酶转化法，以精氨酸为底物，腐胺产量能达到160g/L。本发明提供的生产腐胺的方法过程简单并且原料容易获得，具有良好的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及一种生产腐胺的工程菌及方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

腐胺(putrescine)，又称1,4丁二胺，线性分子式为NH₂(CH₂)₄NH₂，广泛分布于微生物、植物和动物体内，是一种重要的生理活性物质。在工业、农业和医药领域具有广泛的应用前景。

在目前的报道中，生物体中腐胺主要有两条合成途径，如图1所示：

(1)L-精氨酸在精氨酸脱羧酶的脱羧作用下生成胍基丁胺，同时释放CO₂；然后，胍基丁胺在胍基丁胺脲水解酶的作用下脱去一分子尿素，生成产物腐胺。此途径在动物、植物和微生物体内，是最为常见的腐胺合成的途径。在Escherichia coli中，精氨酸脱羧酶共分为两类，一种为诱导型精氨酸脱羧酶(由AidA基因编码)，另一种为生物合成型精氨酸脱羧酶(由speA基因编码)。前者在酸性条件下发挥功能，脱羧过程中会消耗一分子质子，从而防止质子在胞内聚集，保证菌体在低pH下生存。在中性pH下，腐胺主要由speA编码的精氨酸脱羧酶来合成腐胺。本文选用speA编码的精氨酸脱羧酶进行催化。

(2)L-精氨酸经精氨酸酶的水解作用生成鸟氨酸，鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶(ODC)的作用下生成产物腐胺，同时释放CO₂。研究表明，外源添加L-精氨酸时，E.coli会选择利用ADC途径合成腐胺，不经过鸟氨酸途径。

目前，合成途径中的ADC和AUH在菌株体内，受到严格的调控。对于ADC，DavidR.Morris.et al.的研究表明，Mg²⁺、精氨酸和腐胺对ADC有竞争性抑制关系。数据显示，低浓度的Mg²⁺将会大大降低ADC的催化活力，同时也会加剧腐胺的产物抑制。精氨酸浓度高于一定浓度时，腐胺的产量反而会下降。精氨酸同样会对AUH产生竞争性抑制(Ki＝9×10^-3M)。由于双酶在菌体内均收到一定程度的反馈抑制，从而导致利用此途径合成的腐胺量非常低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是以L-精氨酸为底物高效合成腐胺，尤其是构建双基因共表达工程菌，利用该工程菌催化L-精氨酸合成腐胺，实现腐胺的高效生产。

本发明提供了以廉价L-精氨酸为底物合成腐胺的方法。L-精氨酸被精氨酸脱羧酶脱羧生成胍基丁胺和CO₂。随后，胍基丁胺被胍基丁胺脲水解酶催化生成腐胺。本发明选择的野生型精氨酸脱羧酶(ADC)来源于Escherichia coli BL21(DE3)，其编码基因为speA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，对应的氨基酸序列如GenBank号QJZ13350.1所示。选择的野生型胍基丁胺脲水解酶(AUH)来源于Escherichia coli BL21(DE3)，其编码基因为speB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，对应的氨基酸序列如Genbank号为QJZ13349.1所示。

本发明提供了腐胺合成相关的酶的突变体，所述酶为精氨酸脱羧酶和胍基丁胺脲水解酶；

在一种实施方式中，精氨酸脱羧酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

在一种实施方式中，胍基丁胺脲水解酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。