[发明专利]一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母

说明书

本发明公开了一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母，所述毕赤酵母包括如SEQ ID No.1所示DNA序列的重组猪α1干扰素基因片段和如SEQ ID No.2所示DNA序列的蛋白质二硫键异构酶PDI基因片段；通过在毕赤酵母中整合多拷贝重组猪α1干扰素基因片段和插入表达酵母蛋白质二硫键异构酶的DNA片段，辅助蛋白质在酵母细胞内折叠，减少干扰素在细胞内堆积，提高猪α1干扰素分泌到细胞外的量，猪干扰素α1的表达量达到了1.43g/L,较只整合干扰素表达盒的菌株提高了40％以上，显著提高了菌体发酵生产猪α1干扰素的水平，使高拷贝菌株的生产性能得到有效发挥。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种通过辅助分泌高效表达重组猪α1干扰素的毕赤酵母。

背景技术

干扰素(Interferon)根据蛋白质的来源、结构及其受体不同可分为I型、II型和III型，每种类型又包含不同的亚型。目前只有I型中的α和β干扰素以及II型中的γ干扰素被批准应用于预防和治疗病毒感染。猪的α1干扰素编码基因(PoIFNα1)是1986年由法国科学家首次从猪的基因组文库中分离得到的(Lefevre and Bonnardiere,1986)。该基因的完整开放阅读框编码一个长为189个氨基酸的蛋白质，包含一个由23个氨基酸残基组成的信号肽序列(1-23位氨基酸)和由166个氨基酸残基(24-189位氨基酸)组成的成熟蛋白质。成熟的猪干扰素α1由166个氨基酸残基组成，其二级结构以α-螺旋为主。PoIFNα1含有5个半胱氨酸残基，其中Cys1-Cys98，Cys29-Cys138形成两个二硫键。

干扰素是动物机体应对病毒等病原体入侵时较快产生的一种重要细胞因子，干扰素可以通过与动物机体内细胞表面的干扰素受体结合，从而启动一系列干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes)的表达,从而发挥抗病毒和免疫调节作用。I型干扰素主要由白细胞、成纤维细胞和浆细胞样树突细胞分泌产生。PoIFNα1是由猪的白细胞产生的一种耐酸、耐热的糖蛋白，目前被认为是在猪常见的病毒性疾病治疗中最有应用前景的一种干扰素。

干扰素可以通过用有丝分裂剂刺激猪的白细胞后从培养液中进行提取，也可以通过基因工程的方法用大肠杆菌或酵母来进行生产。从白细胞分泌的干扰素进行生化提取方法产量有限、而且存在从动物细胞带入动物病毒的风险。用基因工程工程方法生产干扰素不仅经济，而且安全。用大肠杆菌生产干扰素大多在细胞内积累，其中有大量的干扰素蛋白在表达过程中会形成无活性的聚合体，这种聚合体又称为包涵体。从大肠杆菌中提取干扰素必须要先破碎大肠杆菌的细胞壁和细胞膜，对包涵体进行变性和复性才能获得有活性的干扰素。此外，大肠杆菌细胞壁中的脂多糖(又称内毒素)，对动物是一种较强的致炎和致热因子，因此在提纯过程中必须清除干净。利用毕赤酵母生产的分泌型干扰素是活性形式，而且由于毕赤酵母分泌到胞外的杂蛋白较少，纯化比较容易。毕赤酵母生产干扰素发酵周期较长，一般需要96小时以上，而且发酵液体积较大，纯化前需要进行超滤浓缩处理。中国专利授权号CN103589769B提供了一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，通过将PoIFNα1和硫氧化还原蛋白(Thioredoxin)融合表达的大肠杆菌工程菌，但这种干扰素是融合蛋白，比活性较低。中国专利授权号CN104561199B提供了一种应用重组毕赤酵母稳定地生产猪α干扰素的方法，但由于宿主菌为蛋白酶缺陷型的非野生型毕赤酵母，菌体的生长速度较慢，发酵周期较长。

毕赤酵母表达系统是最常用的重组蛋白质表达系统之一，已有上千种重组蛋白在毕赤酵母中成功进行了表达，并有多种蛋白实现了工业化生产。现有的表达猪α1型干扰素的毕赤酵母工程菌，是通过单拷贝表达猪α1型载体pPICZαA-PoIFNα1整合至X33毕赤酵母基因组醇氧化酶(AOX1)位点，再通过博来霉素抗生素筛选获得的高拷贝菌株。而这种高拷贝菌株由于在开始甲醇诱导后单位时间内酵母细胞内表达重组干扰素蛋白较多，而造成部分干扰素分子不能正确折叠和分泌而在细胞内堆积，不能有效分泌到细胞外，因而使高拷贝菌株的生产性能得不到有效发挥。

可见，现有技术还有待改进和提高。

发明内容