[发明专利]EFTUD2应用及Epro-LUC-HepG2建模法

权利要求书

1.EFTUD2蛋白作为抑制HBV复制的物质的应用，EFTUD2蛋白通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因ISGs的生成来抑制HBV复制的应用。

2.EFTUD2靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型的应用。

3.一种建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于以EFTUD2为靶点，包括如下步骤：

步骤S1、融合PCR技术获得目的序列Epro0.5-LUC

通过融合PCR技术将hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列与萤火虫荧光素酶报告基因整合成融合基因；

步骤S2、构建LV6- Epro-LUC重组慢病毒

通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒，LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒同包装质粒一起转染293T细胞，进行慢病毒包装，并进行滴度检测，获得LV6-Epro0.5-LUC慢病毒；

步骤S3、LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞

用LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞，感染后换新鲜完全培养基继续培养；

步骤S4、建立Epro-LUC-HepG2单克隆稳转株

对长出的多克隆细胞通过有限稀释法挑选出单克隆细胞株，对单克隆细胞株进行测序验证目的序列是否克隆进细胞基因组，并通过荧光素酶实验检测单克隆细胞株的荧光素酶活性，挑选出活性最高的细胞株进行扩大培养，建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型。

4.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于：还包括嘌呤霉素致死浓度筛选的步骤，筛选出能够完全杀死HepG2细胞的最适puro 浓度；

步骤S4中所述有限稀释法所采用的培养基为能够完全杀死HepG2细胞的最适puro 浓度培养基。

5.根据权利要求3所述的建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，其特征在于：步骤S1包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应，通过2轮PCR反应获得单一的目的Epro0.5-LUC条带；

第一轮PCR反应:分别获得hEFTUD2pro-0.5kb和LUC两段序列；

分别以前期PCR反应获得的hEFTUD2pro-0.5kb基因序列和Luciferase基因序列作为模板，经一轮PCR反应得到基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；

第一轮PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收Epro0.5-LUC基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；

第一轮PCR反应:用EpL-CEF和EpL-CER引物进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应产物经电泳回收后的Epro0.5-LUC基因片段一hEFTUD2pro-0.5kb和基因片段二LUC；

所述片段一hEFTUD2pro-0.5kb为hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列；

所述基因片段二LUC为萤火虫荧光素酶报告基因；

所述Epro0.5-LUC条带为整合成的融合基因。