[发明专利]EFTUD2应用及Epro-LUC-HepG2建模法

说明书

本发明为EFTUD2应用及Epro‑LUC‑HepG2建模法。EFTUD2蛋白可以通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG‑1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因（ISGs）的生成来抑制HBV复制。本发明通过以EFTUD2为靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型，可以供研究和发掘新的分子靶向药物。在该模型基础上筛选能够上调EFTUD2基因表达化合物，为HBV慢性感染患者尤其临床IFN‑α治疗应答不佳患者提供更多的治疗选择。

技术领域

本发明涉及基因领域，具体的说涉及EFTUD2为靶点的应用及建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种具有高度种属特异性和组织特异性的部分环状双链DNA病毒。其感染会引起肝功能异常、肝炎，部分患者后期会进展为肝硬化甚至肝癌。我国是HBV感染重度流行国家，约有9000万HBV慢性感染者，其中有2800万人迫切需要抗病毒治疗，有700万人正在承受着晚期肝病的痛苦和向肝癌转化的风险。目前用于治疗乙肝病毒(HBV)慢性感染的两种药物干扰素(IFN)和核苷酸类似物(NAs)对慢性乙型肝炎(CHB)的治愈率仍不理想。

发明内容

发明人临床观察发现，HBV慢性感染患者体内EFTUD2基因的表达水平较非感染患者偏低。CHB患者中干扰素应答不佳者EFTUD2表达水平低。

发明人发现，EFTUD2蛋白可以通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因(ISGs)的生成来抑制HBV复制。

进一步的，发明人提出设想：通过以EFTUD2为靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型，以供研究和发掘新的分子靶向药物。在该模型基础上筛选能够上调EFTUD2基因表达化合物，以期为HBV慢性感染患者尤其临床IFN-α治疗应答不佳患者提供更多的治疗选择。

由此，本发明提出一种EFTUD2蛋白作为抑制HBV复制的物质的应用。

进一步的，提出EFTUD2蛋白通过剪接作用调节固有免疫信号通路中关键信号分子RIG-1、MDA5 mRNA的生成，从而影响干扰素刺激基因ISGs的生成来抑制HBV复制的应用。

进一步的，提出EFTUD2靶点建立稳定的化合物筛选细胞模型的应用。

进一步的，提出一种建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型的方法，以EFTUD2为靶点，包括如下步骤：

步骤S1、融合PCR技术获得目的序列Epro0.5-LUC

通过融合PCR技术将hEFTUD2pro-0.5kb启动子序列与萤火虫荧光素酶报告基因整合成融合基因；

步骤S2、构建LV6-Epro-LUC重组慢病毒

通过XbaI和BamHI双酶切将融合基因同源重组进LV6载体中构建LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒，LV6-Epro0.5-LUC穿梭质粒同包装质粒一起转染293T细胞，进行慢病毒包装，并进行滴度检测，获得LV6-Epro0.5-LUC慢病毒；

步骤S3、LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞

用LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2细胞，感染后换新鲜完全培养基继续培养；

步骤S4、建立Epro-LUC-HepG2单克隆稳转株

对长出的多克隆细胞通过有限稀释法挑选出单克隆细胞株，对单克隆细胞株进行测序验证目的序列是否克隆进细胞基因组，并通过荧光素酶实验检测单克隆细胞株的荧光素酶活性，挑选出活性最高的细胞株进行扩大培养，建立Epro-LUC-HepG2单克隆细胞模型；