[发明专利]一种多肽螺旋构象稳定化方法

权利要求书

1.一种多肽螺旋构象稳定化方法，其特征在于：

利用化学键将多肽N末端氨基与N端第4、5、8或12位侧链巯基之间进行共价交联，以使多肽获得稳定的螺旋构象。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：针对一个特定序列的线性多肽，将位于多肽的N端第4、5、8或12位的氨基酸突变为含有巯基的氨基酸，并通过标准的Fmoc固相合成进行线性肽的拼接；

步骤2：完成N末端最后一个氨基酸拼接后，脱除N末端Fmoc基团，随后在缩合剂的存在下，采用封闭剂封闭多肽的N末端氨基；

步骤3：通过三氟乙酸切割液将多肽从树脂上进行解离，乙醚沉淀，获得线性多肽前体；

步骤4：共价交联

4a、对于N端第4、5或8位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，将线性多肽前体溶解在DMF/H₂O的混合溶剂中，外加双(溴甲基)苯试剂，在弱碱性条件下将多肽的N末端巯基与N端第4、5或8位的半胱氨酸共价交联，最后利用反相液相色谱进行纯化分离；

4b、对于N端第12位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，线性多肽前体首先在DMF/H₂O的混合溶剂中与1，6-己二硫醇发生迈克尔加成反应；接下来溶解在乙酸和水的混合溶剂中，并在AgOAc的作用下，脱去N端第12位半胱氨酸的侧链Acm保护基团；最后在DMF/H₂O的混合溶剂中，通过双(溴甲基)苯试剂或者双(溴甲基)联苯完成N末端巯基与N端第12位半胱氨酸的共价交联，并通过液相色谱进行纯化分离。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤2中，所述封闭剂包括3-(三苯甲硫基)丙酸、2-(三苯甲硫基)乙酸、4-(三苯甲硫基)丁酸、2-(三苯甲硫基)异丁酸、3-(三苯甲硫基)异丁酸、6-(三苯甲硫基)己酸、8-(三苯甲硫基)辛酸、11-(三苯甲硫基)十一烷酸、12-(三苯甲硫基)十二酸、16-(三苯甲硫基)十六酸、3-(三苯甲硫基)苯甲酸、4-(三苯甲硫基)苯甲酸、4-(三苯甲硫基)苯基乙酸、4-(三苯甲硫基)氢化肉桂酸、2-(三苯甲硫基)烟酸或丙烯酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

对于N端第4、5、8位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，N末端氨基采用3-(三苯甲硫基)丙酸、2-(三苯甲硫基)乙酸、4-(三苯甲硫基)丁酸、2-(三苯甲硫基)异丁酸、3-(三苯甲硫基)异丁酸、6-(三苯甲硫基)己酸、8-(三苯甲硫基)辛酸、11-(三苯甲硫基)十一烷酸、12-(三苯甲硫基)十二酸、16-(三苯甲硫基)十六酸、3-(三苯甲硫基)苯甲酸、4-(三苯甲硫基)苯甲酸、4-(三苯甲硫基)苯基乙酸、4-(三苯甲硫基)氢化肉桂酸或2-(三苯甲硫基)烟酸)进行封闭；对于N端第12位的氨基酸突变为半胱氨酸的序列，N末端氨基采用丙烯酸进行封闭。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤4a中，所述弱碱性条件是指pH＝8。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤4a中，反相液相色谱纯化分离的条件为：流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，V/V；流速3mL/min，方法：2→2→90→90→90B％，Time/min：0→2→30→35→40。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤4b中，液相色谱纯化分离的条件为：流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，V/V；流速3mL/min，方法：2→2→90→90→90B％，Time/min：0→2→30→35→40。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

本方法获得的多肽，在N末端氨基与N端第4、5、8或12位的侧链巯基之间通过如下结构的连接臂实现共价交联：