[发明专利]一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法

说明书

本发明提供一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法，包括半抗原的制备：通过琥珀酸酐法对与硫丹具有相似结构的硫丹醇进行衍生化，引入羧基，制备得到硫丹半抗原；完全抗原的制备：将所述硫丹半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原；单克隆抗体的制备：用所述免疫原免疫小鼠制备硫丹单克隆抗体；胶体金免疫层析试纸的制备：将所述二抗涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，将所述包被原喷涂在硝酸纤维素膜作为检测线。本发明适宜现场大量样本快速筛选，灵敏度高、检测速度快、成本低和无需仪器辅助，可实现对硫丹的现场检测，该方法适用于食品安全检测领域。

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，尤其涉及一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法。

背景技术

硫丹又称赛丹、硕丹和安杀丹，其化学名称是1,2,3,4,7,7-六氯双环(2,2,1)-庚烯-(2)双羟甲基-5,6-亚硫酸酯，分子式为C₉H₆Cl₆O₃S，主要由两种同分异构体(α-硫丹和β-硫丹)的混合物的形式存在。硫丹是于1945年研发合成的一种环戊二基类的机氯农药，由于其杀虫效果好且持效性强而广泛应用于水果、蔬菜和茶叶等农作物的害虫防治，通过与氯离子通道结合，阻碍氯离子的内流而导致神经毒性作用使虫体死亡。硫丹是一种典型的持久性有机污染物(POPs)，国家癌症机构通过动物实验证实了POPs是诱发癌症的重要原因之一。另外，硫丹在环境中具有高生物毒性、持久性和远距离迁移等特点，可以在水源、食物链和人体组织中长期地累积，其潜在的致癌性能够对人体造成持续性的危害，因此引起了国内外广泛的关注。2011年，硫丹被列入《斯德哥尔摩公约》中的禁用物质列表当中，2019年3月26日，我国全面禁止硫丹在农业中的应用，食品中农药最大残留限量中规定硫丹在蔬菜和水果类残留限量为0.05mg/kg。

目前，针对硫丹的检测方法主要依靠传统的仪器分析方法，主要包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-串联质谱联用(GC-MS)和液相色谱-串联质谱联用(LC-MS)。上述分析方法的检测速度慢，需要昂贵的仪器和专业的操作人员，且受样本前处理的影响较大，其应用范围受到一定的限制，无法满足现场大量样本的快速检测。免疫学检测方法是基于抗原抗体的特异性反应，并通过显色进行检测的一种方法。目前国内已授权或公告的关于硫丹的免疫分析检测方法仅有两篇。快速检测硫丹、DDT残留的胶体金试纸(授权公告号：CN2844924Y)中的硫丹的胶体金试纸的最低检出限量为0.5～1mg/kg，无法满足国家的限量标准。有机氯农药硫丹人工抗原和抗体及其制备方法与应用(公开号：CN1700001A)中建立的ELISA方法，实验操作步骤繁琐和耗时长，检测结果需借助仪器辅助，不适宜现场快速检测。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明提供一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条及其制备和检测方法，通过制备高质量的硫丹单克隆抗体，而后在基于单克隆抗体之上建立检测速度快、成本低、灵敏度高的胶体金免疫层析试纸条，所述试纸条仅特异性的检测硫丹，检测速度快、成本低、无需仪器辅助，适宜现场大量样本的快速检测和筛选。

一种快速检测硫丹的胶体金免疫层析试纸条制备方法，包括以下步骤：

半抗原的制备：通过琥珀酸酐法对与硫丹具有相似结构的硫丹醇进行衍生化，引入羧基，制备得到硫丹半抗原；

完全抗原的制备：将所述硫丹半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原；

单克隆抗体的制备：用所述免疫原制备单克隆抗体，用所述包被原通过ic-ELISA检测筛选，进行细胞融合，得到硫丹单克隆抗体；

胶体金免疫层析试纸的制备：将所述二抗涂在硝酸纤维素膜上作为质控线，将所述包被原喷涂在硝酸纤维素膜作为检测线，再按照试纸条的结构进行组装。

上述方案中，所述半抗原的制备方法具体为：