[发明专利]一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用

权利要求书

1.一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

在双链DNA的5′端连接自杀基因，3′端连接自杀基因的启动子，再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合，转入待编辑的细胞中完成CRISPR-Cas9基因编辑；

其中，所述自杀基因为DTA，所述自杀基因的启动子为CMV，所述自杀基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述自杀基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

且所述自杀基因正向放于双链DNA的5′端，所述自杀基因的启动子正向放于双链DNA的3′端。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2~10 ng/μL；

所述CRISPR-Cas9反应体系包括sgRNA和Cas9 mRNA；

所述sgRNA的工作浓度为2~8 ng/μL；

所述Cas9 mRNA的工作浓度为5~15 ng/μL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链DNA由限制性内切酶I和限制性内切酶II酶切载体得到，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为同向突出非同尾酶或非同向突出酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为非同向突出酶，所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为5′-3′，所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为3′-5′；

或者，所述限制性内切酶I和限制性内切酶II为非同向突出酶，所述限制性内切酶I酶切后形成的粘性末端为3′-5′，所述限制性内切酶II酶切后形成的粘性末端为5′-3′。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待编辑的细胞包括小鼠受精卵。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

在双链DNA的5′端连接自杀基因，3′端连接自杀基因的启动子，再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合；

其中，所述CRISPR-Cas9反应体系中sgRNA的工作浓度为2~8 ng/μL，Cas9 mRNA的工作浓度为5~15 ng/μL，所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合后的浓度为2~10 ng/μL；

而后，转入小鼠受精卵中，得到基因编辑后的受精卵细胞。

7.如权利要求1~6任一项所述的方法在构建CRISPR-Cas9基因编辑方法中的应用。