[发明专利]一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用

说明书

本发明提供一种减少CRISPR‑Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。所述方法包括如下步骤：在双链DNA的5′端连接自杀基因，3′端连接自杀基因的启动子，再将所述双链DNA与CRISPR‑Cas9反应体系混合，转入待编辑的细胞中完成CRISPR‑Cas9基因编辑。将自杀基因元件及其启动子元件分别连接在dsDNA的两端，当发生DNA串联时，启动子和自杀基因串联在一起，诱导自杀基因表达，从而杀死宿主细胞，使宿主细胞死亡从而消除DNA串联现象。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，涉及一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法。

背景技术

自杀基因（suicide gene），是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的产物为毒性物质或可催化无毒的前体转变为毒性物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死，此类基因称为自杀基因。DTA和TK是真核细胞中常用的两种自杀基因，其中DTA无需添加底物即可产生毒性物质，TK需要添加底物才会起到自杀作用。目前自杀基因常用来治疗肿瘤、感染性疾病，基因工程中也常作为负筛选。

随着人们对非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组（Homologous recombination，HR）这两种修复方式的深入研究和解读，DNA修复机制被逐渐应用于基因编辑技术，用于定向改造基因。研究者采用核酸酶技术使DNA双链有目的性的产生断裂，利用这一机制调控目的基因表达或引入选择性标记。

CRISPR-Cas9介导的同源定向DNA修复是在包括小鼠和人类在内的多种模式生物中进行精确基因编辑的首选方法。Cas9蛋白剪切DNA双链形成DNA双链断裂（Double strandbreaks，DSBs），利用NHEJ修复机制，随机缺失或插入碱基造成移码突变，目的基因实现敲除；在剪切同时引入一段外源基因，NHEJ会将其接入DSBs位点，实现基因插入；或者在两端分别设置剪切位点，中间片段游离，两端通过NHEJ机制连接形成大片段基因敲除。同时，在剪切的同时加入带外源基因及同源序列，HR机制作用下可实现基因定点精确的敲进和替换。目前生物医学界广泛使用了这种方法，使其编辑更加高效和序列更加特异型。

尽管如此，该技术仍然存在缺陷。有研究发现，在六种不同条件敲除小鼠模型的建立过程中，供体DNA模板出现多次不必要的头尾串联现象。在大多数情况下，传统的PCR分析未能识别出这些多重整合事件，这严重影响了该技术的精确性（详见Skryabin BV, et al.Pervasive head-to-tail insertions of DNA templates mask desired CRISPR-Cas9-mediated genome editing events. Sci Adv. 2020;6(7):eaax2941.）。

在CRISPR-Cas9基因打靶过程中，重组DNA片段存在头对尾的串联现象，串联导致基因打靶失败。本领域通常用Southern、qPCR、PCR等方法检测是否有串联，但是尚未见有效的减少串联的方法。

因此，利用自杀基因来降低CRISPR-Cas9基因打靶中重组DNA片段的串联率，对CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展和完善具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA（dsDNA）片段串联的方法，所述方法包括如下步骤：在双链DNA的5′端连接自杀基因，3′端连接自杀基因的启动子，再将所述双链DNA与CRISPR-Cas9反应体系混合，转入待编辑的细胞，完成CRISPR-Cas9基因编辑。